Трехмерные модели культуры клеток для измерения действию тканевой жидкости потока на опухолевой инвазии сотовых

Целью данной процедуры является воздействие интерстициального тока жидкости на клетки, культивируемые в 3D, и количественная оценка влияния этого потока на инвазию клеток. Для этого сначала готовят гелевый раствор, состоящий из коллагена I типа и Matrigel. На втором этапе в гелевый раствор добавляют клетки в заданной концентрации.

Затем клеточную суспензию переносят в трансвелл диаметром 12 мм с размером пор 8 мкм и инкубируют при 37 °C до гелеобразования матрикса. Заключительным этапом подготовки анализа является добавление определенного объема среды в трансвеллы для создания условий статики и потока. Через 24 часа мембраны трансвеллов фиксируют, окрашивают и визуализируют для количественного определения числа инвазивных клеток.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как микрофлюидные камеры интерстициального потока, является отсутствие необходимости в использовании насосов или специализированного оборудования, что позволяет исследователям легко и быстро тестировать множество условий или вариантов обработки. Хотя этот метод позволяет получить представление о миграции и инвазии клеток, его также можно использовать для изучения влияния интерстициального потока жидкости на другие важные аспекты клеточного поведения, такие как экспрессия белков, пролиферация клеток и изменения в клеточной сигнализации. Демонстрация данной процедуры будет представлена с использованием LIMA two chaa.

Аспирант в моей лаборатории начинает эту процедуру с того, что помещает небольшую аликвоту Matrigel на лед при температуре 4 °C. Затем подготавливают состав геля, состоящий из стерильной воды с PBS, гидроксида натрия, Matrigel и коллагена I типа из хвоста крысы. После этого компоненты геля смешивают на льду в той же последовательности и инкубируют полученный раствор в течение одного часа при температуре 4 °C.

Теперь с помощью стерильного пинцета поместите в 12-луночный планшет вставки для культивирования клеток диаметром 12 мм. Затем подсчитайте количество клеток и ресуспендируйте их в безсывороточной среде до концентрации 5 × 10⁶ клеток/мл, после чего добавьте 100 µL клеточной суспензии к 900 µL раствора геля. Затем тщательно перемешайте их, осторожно пипетируя содержимое вверх и вниз.

Затем добавьте по 150 µL конечной смеси в каждый вкладыш. После этого перенесите вкладыши в инкубатор при 37 °C и 5% CO2 на 30 минут до полимеризации геля. Для статических условий добавьте 100 µL безсывороточной среды поверх геля и 1 200 µL под вкладыш.

Уровни жидкости внутри и снаружи вставки в лунке должны быть примерно одинаковыми, чтобы разница давлений через гель была минимальной и отсутствовал интерстициальный ток. Для создания условий потока добавьте 100 µL безсывороточной среды под вставку и 650 µL над гелем. При этом старайтесь избегать образования пузырьков воздуха под вставкой, так как они будут препятствовать миграции клеток через мембрану в этих местах.

Затем поместите планшет в инкубатор при 37 °C и 5% carbon dioxide на 24 часа. На этом этапе добавьте по 500 µL 1× PBS в каждую лунку нового 24-луночного планшета для промывки вставок. Затем удалите среду, оставшуюся в верхней части лунок с потоковыми вставками.

Затем с помощью ватных палочек удалите гель из вставок. Протрите верхнюю поверхность мембраны, чтобы удалить клетки, не являющиеся VA-клетками. После этого промойте вставки, поместив их на 15 секунд в 24-луночный планшет с 1× PBS.

После этого удалите PBS и добавьте по 500 µL 4% параформальдегида под каждый вкладыш. Инкубируйте их в течение 30 минут при комнатной температуре для фиксации трансмигрировавших клеток. Затем удалите PFA и один раз промойте вкладыши 500 µL PBS для удаления остатков фиксатора.

Затем добавьте 500 µL 0,5% раствора Triton X 100 под вставки и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре. Для пермеабилизации клеток вырежьте мембраны из вставки с помощью лезвия бритвы. Затем поместите их в 100 µL раствора DPI в концентрации 2 µg/mL в 1× PBS.

Расположите мембрану так, чтобы ее нижняя сторона была обращена вниз. Раствор DPI необходимо приготовить за несколько минут до использования и хранить в темноте. Теперь оберните планшет алюминиевой фольгой.

Поместите образец на шейкер при 150 RPM на 30 минут при комнатной температуре. Затем промойте мембраны один раз в 500 µL PBS и снова поместите их на шейкер на 10 минут. Для удаления свободного jy повторите промывку еще дважды.

Следующий шаг заключается в размещении мембран на предметных стеклах трансмигрировавшими клетками вверх. Добавьте на мембраны смоле для заключения препаратов. Затем накройте их покровными стеклами.

После этого подсчитайте количество ядер, окрашенных красителем, и рассчитайте число инвазивных клеток в соответствии с сопроводительным руководством. На данном рисунке показаны клетки MDA MB 4 35 s, мигрировавшие через мембрану. После проведения анализа инвазии в условиях потока интерстициальной жидкости инвазивные клетки были зафиксированы и окрашены с помощью DPI и конъюгата Alexa Fluor 4 88 с phalloidin для облегчения подсчета инвазивных клеток.

На данном изображении представлена мембрана при светлопольном освещении, а здесь — ядра, окрашенные DAPI. Здесь показаны F-актин, окрашенный Alexa Fluor 488. Этот график демонстрирует, что инвазия метастатических клеток меланомы MDA MB 435 значительно усиливалась под воздействием интерстициального потока.

Через 24 часа результаты нормируются по среднему значению для условий статической инвазии, и представляется среднее значение по шести вставкам для культивирования клеток. Различие между условиями статистически значимо при значении P = 0.003. После освоения методики подготовка анализа потока интерстициальной жидкости занимает два часа, затем следует 24-часовая инкубация и еще два часа на фиксацию и окрашивание трансвелл-мембран.

После выполнения данной процедуры можно легко выделить клетки, белки или нуклеиновые кислоты, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, о том, как экспрессия генов и белков изменяется в ответ на ток интерстициальной жидкости. С момента разработки этот метод стал основным анализом для исследователей, изучающих влияние интерстициального потока на раковые клетки.