Улучшена визуализация метастазов в легких на одной резолюции сотовый у мышей, комбинированные

Общая цель данной процедуры заключается в улучшении детекции микрометастазов в легких мыши ex vivo при сохранении архитектуры раздутых легких. Это достигается путем первоначальной перфузии легких in situ раствором PBS для удаления крови, которая является основным источником цветового фона в данной ткани. Следующие этапы включают раздувание легких путем введения PFA с последующим пережатием для фиксации легочной ткани в раздутом состоянии.

Затем легкое извлекают и подвергают дальнейшей фиксации в PFA или же отдельные доли легкого заливают для криорезки. Заключительные этапы включают окрашивание тканей в растворе Xal и визуализацию опухолевых клеток LA zag; в итоге метастазы в целых долях легкого или в срезах легочной ткани можно обнаружить вплоть до уровня единичных клеток с помощью бинокулярного или светового микроскопа. Основным преимуществом данного метода перед существующими способами, такими как sky standing on its own, является значительное улучшение выявляемости микрометастазов за счет удаления фона, связанного с кровью.

Начните выполнение протокола с анестезии мыши путем внутрибрюшинного введения кетамина, ксилазина и ацепромазина в примерно 150 µL PBS. После исчезновения болевых рефлексов зафиксируйте мышь на операционном столе. Выбрейте шерсть на спине и обработайте кожу 70% этанолом.

Разрежьте кожу от брюшной полости до шеи. Отодвиньте кожу в стороны или удалите её. Осторожно вскройте брюшину в области грудной клетки, чтобы предотвратить разрыв крупных сосудов, таких как яремные вены.

Это повысит эффективность перфузии. Теперь перережьте нижнюю полою вену под печенью, используя шприц объемом 20 мл с иглой калибра 21–24 G. Медленно введите от 10 до 15 мл PBS в правый желудочек бьющегося сердца до тех пор, пока легкое не станет полностью белым и сердце не перестанет биться.

Затем пережмите сосуды выше печени и диафрагмы сосудистым зажимом. Наберите в шприц объемом 10 мл 3% параформальдегид и с помощью иглы калибра 21–24 введите примерно два миллилитра в правый желудочек.

Обнажите трахею за пределами грудной клетки и раздуйте легкое, введя в трахею около трех миллилитров альдегида извне грудной полости. Сразу после извлечения иглы пережмите трахею в месте прокола сосудистым зажимом и подождите 10 минут для завершения фиксации. Затем пересеките кровеносные сосуды выше сосудистого зажима.

Затем снимите зажим и введите примерно два миллилитра PBS в правый желудочек, чтобы удалить избыток формальдегида. Проколите иглой нижние части всех долей легких и снимите сосудистый зажим с трахеи. Теперь введите в трахею от трех до пяти миллилитров разведенного фиксирующего раствора, следуя той же процедуре, что и при предыдущем введении.

Прекратите инъекцию, когда параформ в долях легких будет заменена раствором. Осторожно извлеките легкие, потянув за сердце пинцетом и перерезав соединительнотканные связки, кровеносные сосуды и трахею. Обязательно сохраните связь сердца с легкими.

Отложите одну долю для криосрезов, а оставшуюся ткань легкого используйте для окрашивания всего органа. Поместите легкое в пластиковый стакан с плотно закрывающейся крышкой и зафиксируйте его в 2% растворе формальдегида и PBS. Положите сверху на легкое кусочек марли, чтобы удерживать его в растворе, и оставьте при комнатной температуре на 30 минут.

Через полчаса удалите фиксирующий раствор и тщательно промойте ткань в PBS 3 раза. Приготовьте свежий рабочий раствор Xal, разбавив 1 мл стокового раствора Xal в соотношении 1:40 в базовом красящем растворе, и добавьте не менее 10 мл этого раствора в стакан. Погрузите легкое, используя кусочек марли. Неплотно закройте крышку для обеспечения газообмена и инкубируйте при 37 °C в течение трех-пяти часов в защищенном от света месте.

После инкубации удалите раствор xal. Промойте легкие один раз PBS для удаления остатков раствора xal и добавьте не менее 10 milliliters 4%paraform aldehyde в PBS. Теперь ткань готова к гистологическому исследованию и может храниться в течение длительного времени в 4%PFA при температуре four degrees Celsius.

Начните с заполнения одной трети формы для заливки неразбавленной средой для заливки poly forze. Затем поместите долю легкого в форму и продолжайте добавлять среду до полного покрытия доли. Тщательно избегайте образования пузырьков воздуха, после чего инкубируйте залитую долю при температуре 4 °C в течение 20 минут.

Затем подготовьте залитые легкие к срезанию, медленно замораживая их в смеси сухого льда и изопентана. При необходимости образцы можно перенести в морозильную камеру при температуре -80 °C для хранения. На криостате сделайте криосрезы доли доли толщиной от 7 до 10 мкм и закрепите срезы на имеющихся в продаже предметных стеклах для криосрезов. После закрепления немедленно инкубируйте срезы в окрашивающем растворе XAL при температуре 37 °C в течение 24 часов в увлажненной камере. На следующий день дважды промойте стекла в PBS по пять минут за каждое промывание.

После этого кратко промойте препарат в дистиллированной воде. Теперь проведите докрашивание предметных стекол ядерным быстрым красным (nuclear fast red) в течение 10 секунд, чтобы получить слабый контрастный фон, на котором xal будет более выраженным, и немедленно смойте краситель дистиллированной водой. Для получения более темного контрастного фона увеличьте время окрашивания до 30 секунд или более.

Закрепите стекла с помощью иммунозакрепителя. Было повторно исследовано образование метастазов в моделях остеосаркомы (OS) мышей, в которых использовались клетки done LM eight. Ниже представлены репрезентативные изображения перфузированных и неперфузированных легких мышей, которым одновременно вводили трансдуцированные laxy и нетрансдуцированные контрольные клетки done и LM eight, а также мышей, которым вводили контрольные клетки done.

Макроскопические и микроскопические метастазы оставались необнаруживаемыми в неперфузированных и перфузированных легких. Однако интересно, что у мышей, которым вводили клетки dun LA Z, окрашивание xgl выявило синие микрометастатические очаги из одиночных клеток или небольших клеточных кластеров на поверхности неперфузированных легких; перфузия и фиксация легких in situ дополнительно улучшили обнаруживаемость микрометастазов dun la z, однако роста до макроскопических очагов у мышей, которым вводили контрольные клетки LM eight, не наблюдалось; в неперфузированных легких были распознаны полупрозрачные, едва заметные макрометастатические очаги диаметром более 0,1 millimeter. Перфузия легких не улучшила обнаружение этих очагов.

Однако у мышей, которым вводили клетки ate LAC Z, на поверхности неперфузируемых органов было обнаружено множество макрометастазов, окрашенных X gal в синий цвет. Также на поверхности неперфузируемых органов были обнаружены микрометастазы. Более того, перфузия легких дополнительно улучшила выявляемость макро- и микрометастазов.

Следовательно, микро- и макрометастазы стали видны с более высокой плотностью и в большем количестве, главным образом благодаря прозрачности перфузируемой ткани, в результате чего стали заметны и очаги, расположенные под поверхностью органа. Дополнительный гистологический анализ с использованием криосрезов ткани легких подтвердил улучшенную выявляемость метастазов в легких у мышей, которым ввели трансдуцированные клетки Dun LAX Z и LM8, а также у мышей с первичными опухолями, полученными из клеток Dun LAX Z. В срезах легких были обнаружены микрометастазы и даже отдельные клеточные очаги.

Это не наблюдалось у мышей с первичными опухолями из соответствующих контрольных клеток. Более того, макрометастазы были более отчетливо видны у мышей, которым вводили клетки LM eight LA C, чем у животных с контрольными клетками LM eight. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить перфузию и фиксацию легких в ZI two, а также последующее окрашивание метастазов в иссеченных легких.

Данный метод представляет собой высокочувствительный конечный анализ распределения метастазов в легких для любого типа исследований рака, а также может служить эталоном для совершенствования современных методов визуализации in vivo, таких как микро-КТ, ПЭТ и МРТ, используемых для раннего обнаружения метастатических очагов.