On-Chip эндотелиальных Воспалительные фенотипирование

Целью данного видео является демонстрация метода «лаборатории на чипе» для характеристики воспалительного состояния эндотелиальных клеток. Для начала эндотелиальные клетки аорты человека выращивают до состояния конфлюэнтности на подложке для культивирования тканей, после чего помещают в устройство для создания сдвигового напряжения на основе пластин Conan. Клетки обрабатывают провоспалительным цитокином TNF alpha и одновременно подвергают воздействию различных условий сдвигового напряжения в течение четырех часов путем точного контроля вращения конуса над подложкой; сдвиговое напряжение модулирует хорошо изученный воспалительный ответ на цитокин.

Это включает повышение экспрессии молекул адгезии, таких как VCAM-1 и ICAM-1. Субстрат переносят на предметный столик микроскопа, где микрофлюидное устройство APDMS герметично фиксируется с помощью вакуума непосредственно к монослою, создавая проточные каналы. Активированные моноцитарные клетки THP-1 пропускают над предварительно кондиционированными HUVEC, где они связываются пропорционально уровню экспрессии молекул клеточной адгезии.

Воспалительное состояние эндотелия определяют путем подсчета общего количества прочно прикрепившихся клеток THP-1. Здравствуйте, меня зовут Ши Диверс, я Грег Фостер, а я Кит Бейли.

Мы находимся в лабораториях профессоров Пастора и Саймона на кафедре биомедицинской инженерии Калифорнийского университета в Дэвисе. Сегодня мы опишем использование подхода на основе лабораторных чипов для количественного изучения эндотелиальной дисфункции и воспаления. Эти инструменты предоставляют платформу для проведения исследований, связанных с наложением метаболического стресса на гидродинамические факторы, а также регуляцией воспалительного фенотипа эндотелия и предрасположенности к атеросклерозу.

Мы называем наши устройства микрофлюидными камерами с имитацией сосудов, или VMMC. Эти устройства позволяют количественно оценивать воспалительные реакции в эндотелиальных клетках и моноцитах в условиях, имитирующих среду в атерогенных сосудах. VMMC облегчает использование небольших количеств реагентов или материалов, запасы которых могут быть ограничены.

Они также могут быть изготовлены с различными настраиваемыми компоновками и геометрией, что делает их подходящими для широкого спектра применений. Сегодня мы продемонстрируем репрезентативный эксперимент с использованием нашего подхода «лаборатория на чипе». Монослои эндотелия человека будут подвергнуты активации цитокинами при четко определенных напряжениях сдвига.

Мы продемонстрируем использование VMC для количественной оценки рекрутирования моноцитов человека к монослою в режиме реального времени в качестве функционального показателя активации эндотелия; с помощью токарного станка из культуральных чашек диаметром 100 мм выфрезеровываются круглые подложки диаметром три дюйма. Подложки диаметром три дюйма промывают дистиллированной водой, затем стерилизуют путем замачивания в 70% ethanol. Стерильные подложки помещают в чашки Петри диаметром 100 мм и оставляют до высыхания.

Затем их инкубируют с коллагеном I типа в концентрации 100 µg/mL в течение одного часа при комнатной температуре и промывают PBS. Эндотелиальные клетки аорты человека (HA) суспендируют в концентрации 650 000 клеток/mL. Один миллилитр клеточной суспензии наносят каплями на высушенную подложку, покрытую коллагеном, и равномерно распределяют по поверхности.

Заселенные субстраты затем помещают в инкубатор при 37 °C и 5% CO2 для прикрепления клеток к поверхности субстрата. Через один час добавляют 9 mL ростовой среды EGM-2; клетки выращивают до образования монослоев. При достижении примерно 90% конфлюэнтности монослои готовы к использованию в последующих экспериментах по сдвигу. Сосудисто-миметические микрофлюидные камеры изготавливают путем заливки PDMS в форму, созданную на основе мастер-шаблона с требуемой геометрией каналов.

Силиконовую основу заливают в пластиковую лодочку для отливки, после чего добавляют силиконовый отвердитель в соотношении 10:1 по массе. Затем гель PDMS тщательно перемешивают, стараясь не задевать стенки лодочки, чтобы в смесь не попали пластиковые частицы. Матрицы из фоторезиста очищают гексаном и подготавливают для формования VMMC.

Затем смесь PDMS выливают на мастер-форму, после чего помещают в вакуумную камеру. В камере воздух удаляется из смеси PDMS и поднимается на поверхность через 15 минут.

Форму извлекают из камеры и осторожно обдувают поверхность PDMS воздухом, чтобы удалить оставшиеся из формы пузырьки воздуха. Затем форму накрывают и помещают в печь при 37 °C на один час для отверждения PDMS. Извлеките затвердевший гель PDMS из печи и с помощью маленького скальпеля сделайте круговые надрезы вокруг камеры.

Крайне важно выполнять это действие постепенно, чтобы избежать контакта с фоторезистом, так как это может повредить мастер-форму. С помощью иглы 19G с системой Luer-Lock вырежьте микрофлюидную камеру из входных и выходных отверстий просечки формы для каждого канала. Кроме того, проделайте отверстия для вакуумных трубок вдали от каналов.

Подготовка VMMC завершена. Добавьте с помощью пипетки провоспалительный цитокин TNF alpha в шесть миллилитров среды L 15 до достижения конечной концентрации 0.5 nanograms per milliliter. Среда L 15 используется здесь в качестве сдвиговой жидкости благодаря ее буферной емкости по pH в отсутствие 5%CO2.

Затем среду набирают в стерильный шприц объемом 10 milliliter, который используется для заполнения устройства сдвига. Конфлюэнтный монослой переносят в устройство сдвига клеток, которое было предварительно стерилизовано этанолом, выровнено, а высота зазора конуса была установлена. Субстрат извлекают из чашки Петри, помещают на стеклянный контрольный блок, центрируют и осторожно вводят в нижнюю часть камеры корпуса так, чтобы конус находился непосредственно над клетками.

Подложку фиксируют, равномерно затягивая винты из нержавеющей стали вокруг концевой меры. Затем в камеру загружают срезающую среду, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха. После этого с помощью компьютера вводят программу заданного напряжения сдвига и включают микрошаговый двигатель.

В данном случае мы используем осциллирующий сдвиг с интенсивностью 0 ± 5 дин/см². Через четыре часа программа сдвига останавливается. Калибровочный блок извлекают, а подложку осторожно помещают обратно в чашку Петри.

Теперь клетки готовы к анализу адгезии моноцитов. Сразу после сдвига монослои HA транспортируют к микроскопу для сборки VMMC. VMMC подключают к вакуумному шлангу и погружают в деионизированную воду для удаления пузырьков воздуха, попавших в каналы.

При изначально закрытом вакуумном клапане камеру осторожно прижимают к монослою, после чего вакуумный клапан открывают. На этом этапе критически важно убедиться в отсутствии пузырьков воздуха в каналах камеры. Затем в резервуар, изготовленный путем отсечения кончика иглы Luer Lock 19G, пипетируют 80 µL HBSS с кальцием и магнием; жидкость вытесняют из кончика, с силой нажимая на верхнюю часть резервуара, который затем вставляют во входной порт VMMC.

Всю сборку помещают на предметный столик микроскопа, затем включают камеру микроскопа и видеомонитор. Стеклянный шприц объемом 10 milliliter устанавливают в шприцевой насос. Затем трубку шприца подключают к выходному порту VMMC.

Скорость потока устанавливают таким образом, чтобы создать напряжение сдвига в один дин на квадратный сантиметр внутри канала, после чего систему переводят в режим заполнения, при котором шприц вытягивает жидкость из резервуара через канал. Клетки P one, стимулированные SDF one, суспендируют в концентрации 2 миллион клеток на миллилитр. В течение двух минут после активации потока в резервуар добавляют 50 µL суспензии клеток.

Снова следует соблюдать осторожность, чтобы не допустить появления пузырьков воздуха при полном развитии потока. Видеозапись производится с частотой 3 кадра в секунду, а данные подсчитываются с помощью программного обеспечения Image J. Адгезивными считаются клетки THP-1, которые перемещаются не более чем на половину диаметра клетки за 10 секунд.

Здесь мы представляем данные, отображающие адгезию THP-1 к монослоям HUVEC, стимулированным TNF-α и подвергнутым либо постоянному высокому касательному напряжению сдвига 15 dyn/cm², либо осциллирующему касательному напряжению сдвига 0 ± 5 dyn/cm². Монослои HUVEC, подвергнутые осциллирующему касательному напряжению сдвига, продемонстрировали трехкратное увеличение рекрутирования клеток THP-1 по сравнению с монослоями, подвергавшимися высокому касательному напряжению сдвига. Сегодня мы демонстрируем использование настраиваемых методов in vitro, которые могут быть скомбинированы для получения важных сведений о ранних воспалительных процессах, лежащих в основе атеросклероза. В частности, мы количественно оцениваем результаты, связанные с эндотелиальной дисфункцией и воздействием воспалительных стимулов на клетки в четко определенных гидродинамических условиях.

Использование VMM CS позволяет исследовать специфические механизмы, лежащие в основе адгезионных взаимодействий между эндотелиоцитами и лейкоцитами. Эти устройства также обладают преимуществами гибкости и низкой стоимости, а также облегчают использование материалов, имеющих ограниченный объем, таких как компоненты сыворотки крови человека. Наши исследования с применением данных устройств включали изучение воспаления в эндотелиальных клетках, индуцированного цитокинами, липидами и RAGE.

Мы также разработали чип-анализы для изучения механизмов адгезии различных типов лейкоцитов, а также в цельной крови. В конечном итоге мы полагаем, что эта технология приведет к созданию методов ex vivo для оценки индивидуального риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, опосредованных воспалением.