Использование BLT Humanized мышь в качестве стволовых клеток на основе модели генной терапии опухолей
18 декабря 2012 г.
Поколения и характеристику опухоли специфические Т-клетки использованием гуманизированных мышей описано здесь. Человека тимуса ткани и генетически измененных человеческих гемопоэтических стволовых клеток пересаживают в ослабленным иммунитетом мышей. В результате восстановление инженерных человеческой иммунной системы, позволяющей в естественных экспертизы противоопухолевого иммунного ответа.
Общая цель следующего эксперимента заключается в создании мышей с искусственно сконструированной иммунной системой человека. Это достигается путем предварительной подготовки мыши к операции, а затем, на втором этапе, введения в троакар фрагмента тимуса. Matrigel смешивают с трансдуцированными CD34-отрицательными и CD34-положительными клетками, после чего полученную смесь вводят в троакар.
Затем конструкции из матригеля трансплантируют под капсулу почки. В конечном итоге за отторжением целевых опухолей генетически модифицированными Т-клетками CD8 можно наблюдать с помощью ПЭТ-визуализации живых объектов и физического измерения размеров опухолей. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими методами, такими как полностью нейронные модели, является то, что он позволяет изучать развитие генетически модифицированных стволовых клеток человека внутри человеческого тимуса и последующее тестирование эффективности полученных линий in vivo; процедуру продемонстрируют три специалиста из наших лабораторий: Грегори Бристоль, Бернард Левин и Шон Ким.
На этой схеме представлена модифицированная модель BLT, использованная в данных исследованиях для создания химерных мышей, несущих mart-специфические T-клетки. Тимус реконструируется из трансдуцированных и нетрансдуцированных клеток CD34, выделенных из аутологичной фетальной печени. Затем часть трансдуцированных клеток замораживается и вводится облученным мышам через четыре-шесть недель.
В данном видео демонстрируется имплантация живого конструкта th после того, как животные стали вялыми под воздействием анестезии. Начните с выбривания шерсти на левой стороне каждой мыши от бедра до плеча в области между центром спины и брюхом. После записи веса каждого животного промаркируйте их уши для нумерации и подкожно введите 0,3 мл карпрофена в плечо каждой мыши.
Затем уложите мышей на правый бок, лицом влево. Теперь промойте троакар иглы для имплантации раковых клеток 16-го калибра с закругленным кончиком раствора PBS. С помощью остроконечного пинцета поместите фрагмент тимуса в чашку с PBS, после чего держите троакар горизонтально по отношению к стержню.
Аспирируйте ткань непосредственно у кончика. Проведение троакара под капсулу почки и введение ткани является одним из самых сложных этапов данной процедуры. Затем привлеките помощника.
Используйте дозатор с положительным вытеснением Eppendorf для добавления 5 µL холодного матригеля в одну пробирку с клетками, осторожно перемешивая содержимое. Удерживая троакар в горизонтальном положении, медленно тяните стержень на себя, пока помощник вносит матригель дозатором.
Подготовьте троакары для каждой мыши. Сначала обработайте открытый участок кожи животного раствором Бетадина, затем протрите его салфеткой с изопропанолом. Дважды определите самое темное пятно под кожей, которое указывает на расположение селезенки.
Почка находится примерно в пяти миллиметрах дорсальнее селезенки; аккуратно приподнимите кожу над почкой с помощью тупых пинцетов. Сделайте разрез кожи длиной около 15 миллиметров параллельно селезенке. Сделайте аналогичный разрез в нижележащем мышечном слое брюшины.
У самцов почка должна быть видна непосредственно. Просто сожмите брюшную полость, чтобы она вышла наружу. Чтобы почка оставалась доступной у самок, удерживая брюшную полость левой рукой, сначала используйте гемостат, чтобы захватить яичник, а затем вытяните почку, чтобы помочь удерживать орган вне тела.
Сделайте небольшое отверстие в заднем конце капсулы почки, затем введите троакар в это отверстие и продвигайте его вдоль почки до тех пор, пока отверстие троакара не будет полностью закрыто капсулой почки. Затем мизинцем правой руки зафиксируйте ткань. Теперь с помощью закрытого гемостата аккуратно верните почку на место.
Завяжите один стежок на брюшине двойным узлом, затягивая кожу подобно затяжке мешочка, а затем зафиксируйте ее двумя хирургическими скобами. В завершение нанесите по одной капле PBS в каждый глаз и поместите мышь в клетку на подстилку, уложив ее на бок. После проведения имплантации всем мышам аналогичным образом убедитесь, что животные снова начали лежать на животах, прежде чем оставить их.
На этом первом рисунке представлено репрезентативное изображение живого имплантата THI у гуманизированных мышей. На данном рисунке продемонстрированы нормальное развитие ткани тимуса и физиологическое распределение человеческих CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов в тканях. После реконструкции животные обладают иммунной системой человека с нормальным распределением CD4- и CD8-положительных T-клеток.
Здесь представлено репрезентативное изображение мыши с меланомой. Серые области соответствуют изображению КТ-сканирования. Цветные области указывают на метаболическую активность опухоли, выявленную с помощью ПЭТ-сканирования.
В данном эксперименте только КТ-сканирование выявило массивную опухолевую массу в области, отмеченной белым кругом. Однако, как показывает ПЭТ-визуализация in vivo, эта область состоит преимущественно из некротической и рубцовой ткани, что подчеркивает преимущество ПЭТ-визуализации как более чувствительного и точного метода оценки регрессии и элиминации опухоли. После этой процедуры можно провести другие анализы, такие как определение фенотипа и активация T-клеток ex vivo, чтобы ответить на вопросы, касающиеся функции T-клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описываются методы получения и характеристики опухоль-специфических T-клеток с использованием гуманизированных мышей. Процесс включает трансплантацию тканей тимуса человека и генетически модифицированных гемопоэтических стволовых клеток человека иммунодефицитным мышам, что приводит к восстановлению иммунной системы человека для исследования противоопухолевых иммунных ответов in vivo.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Онкология
- Трансляционная медицина
Теоретические сведения
- Гуманизированные мышиные модели незаменимы для изучения иммунных ответов человека.
- Генетически модифицированные Т-клетки могут эффективно воздействовать на опухоли.
- Существующие методы могут недостаточно точно имитировать взаимодействия иммунной системы человека.
- Данное исследование направлено на углубление понимания противоопухолевых ответов.
Цель исследования
- Для создания мышей с модифицированной иммунной системой человека.
- Для мониторинга эффективности генетически модифицированных Т-клеток CD8 в борьбе с опухолями.
- Для изучения особенностей развития стволовых клеток человека в тимусе.
Используемые методы
- Подготовка мыши к хирургическим процедурам.
- Трансплантация ткани тимуса, смешанной с трансдуцированными CD34-отрицательными и CD34-положительными клетками.
- Использование Matrigel для создания трансплантата.
- Мониторинг отторжения опухоли с помощью ПЭТ-визуализации в реальном времени и физических измерений.
Основные результаты
- Успешное получение мышей с функциональной иммунной системой человека.
- Эффективный мониторинг отторжения опухоли модифицированными T-клетками.
- Демонстрация преимуществ данного метода по сравнению с существующими моделями.
- Изучение особенностей развития стволовых клеток человека in vivo.
Выводы
- Данный метод позволяет проводить углубленное изучение иммунных ответов человека.
- Он предоставляет платформу для тестирования противоопухолевой терапии.
- Будущее применение может способствовать более глубокому пониманию динамики иммунной системы.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Гуманизированная мышиная модель BLT позволяет проводить прогностическую оценку генной терапии на основе стволовых клеток и функций модифицированных Т-клеток в физиологически релевантном контексте иммунной системы человека. Данная платформа восполняет критический пробел в доклинических исследованиях в области онкологии и иммунотерапии, обеспечивая возможность оценки развития иммунных клеток человека, таргетирования опухолей и терапевтической эффективности in vivo. Ее интеграция повышает уверенность в трансляционном потенциале и снижает риски при принятии решений на ранних этапах разработки портфеля программ клеточной и генной терапии.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет проверять терапевтические гипотезы с использованием модифицированных иммунных клеток человека in vivo.
- Способствует снижению биологических рисков за счет моделирования развития и функций иммунных клеток человека.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней для опухолеспецифических Т-клеточных рецепторов.
- Повышает прогностическую достоверность при разработке клеточной иммунотерапии.
Скрининг и разработка методов анализа
- Обеспечивает валидированную систему in vivo для количественной оценки противоопухолевой активности.
- Позволяет проводить воспроизводимое измерение регрессии опухоли с помощью ПЭТ-визуализации живых объектов.
- Поддерживает стандартизацию фенотипирования иммунных клеток и функциональных анализов после трансплантации.
- Создает надежную платформу для оценки генно-модифицированной клеточной терапии перед клиническим внедрением.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует релевантным для заболевания взаимодействиям между иммунной системой и опухолью человека для поиска трансляционных биомаркеров.
- Обеспечивает непрерывный переход от этапа открытия к доклинической валидации методов терапии с использованием модифицированных иммунных клеток.
- Поддерживает продвижение с учетом рисков, предоставляя данные о механизмах действия и эффективности in vivo.
- Позволяет оценить элиминацию опухоли и персистенцию иммунных клеток в гуманизированном контексте.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данная модель служит связующим звеном между этапами раннего поиска, идентификации ведущих соединений и доклинической валидации кандидатов для клеточной и генной терапии рака и иммунных расстройств.
- Открывающая биология: Обеспечивает проверку гипотез о функции модифицированных Т-клеток и их способности нацеливаться на опухоль in vivo.
- Скрининг: Позволяет получать воспроизводимые количественные данные ПЭТ-визуализации и измерения размеров опухоли для оценки кандидатов.
- Аналитика: Обеспечивает надежные показатели фенотипирования иммунных клеток и оценки их функционального состояния после приживления.
- Трансляционные исследования: Связывает данные об эффективности in vivo с биомаркерами и механистическими конечными точками, имеющими значение для клинического внедрения.
- Корпоративное повторное использование: Создает многоразовую платформу для итерационного тестирования терапии генно-модифицированными иммунными клетками.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую уверенность и снижает механистическую неопределенность при разработке иммунотерапии клеточными препаратами.
- Операционная ценность: Стандартизирует тестирование эффективности in vivo и поддерживает масштабируемые, воспроизводимые рабочие процессы.
- Стратегическая ценность: Позволяет принимать обоснованные решения о продолжении или прекращении разработки («go/no-go») и эффективно управлять капиталом в рамках портфеля.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию с учетом рисков и продвижение активов в области клеточной и генной терапии.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с манипуляциями на стволовых клетках человека и проведением операций на иммунодефицитных мышах.
- Необходим доступ к ПЭТ-визуализации и современной инфраструктуре для содержания животных.
- Требуется строгая стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных.
- При необходимости следует адаптировать протоколы для различных моделей опухолей и стратегий генетической модификации.
- Соблюдение требований по биологической безопасности и благополучию животных в связи с использованием тканей человека и иммунокомпрометированных организмов.
