Оптимизирована процедура для флуоресцентной активированного сортировки клеток (FACS) Выделение вегетативной нервной прародителей из висцеральных органов плода мышей

Общая цель данной процедуры заключается в получении популяции очищенных нейрональных предшественников из ганглиев периферической нервной системы. Для этого сначала из плодов мышей выделяют интересующий орган или конкретные ганглии. Затем ткани подвергают частичной диссоциации, чтобы высвободить отдельные клетки в окружающую среду.

Затем суспензию клеток фильтруют для удаления остаточных фрагментов ткани или крупных агрегатов. В завершение проводят проточную сортировку суспензии клеток для выделения интересующей популяции на основе экспрессии флуоресцентного репортера в данной клеточной популяции. В конечном итоге можно сравнить паттерны экспрессии генов между прогениторами, выделенными на разных стадиях развития, или между очищенными популяциями различных типов нейрональных клеток.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с изоляцией клеточных популяций на основе антительного мечения является то, что иммунореагенты часто недоступны. Изоляция таких клеточных популяций стала возможной благодаря использованию генетически модифицированных линий мышей, которые экспрессируют флуоресцентный белок в определенных подмножествах нейронов, позволяя بذلك метить клетки, экспрессирующие конкретный ген. Хотя в данной работе мы демонстрируем этот метод для изоляции нейральных прогениторов из кишечника и нейрогенного тракта полости рта, его также можно применять к другим модельным системам, экспрессирующим флуоресцентные репортеры.

Как правило, люди, которые только начинают осваивать этот метод, сталкиваются с трудностями, так как склонны подвергать исходные ткани избыточному перевариванию, что приводит к потере жизнеспособности клеток. Перед началом диссекции осмотрите эмбрионы при светлом поле, чтобы убедиться, что соответствующие структуры находятся в фокусе. Затем определите трансген-положительные эмбрионы, проверив экспрессию флуоресцентного репортера с помощью флуоресцентного стереомикроскопа.

После эвтаназирования эмбрионов в чашку для диссекции добавляют минимальное количество PBS, чтобы эмбрион не всплывал во время препарирования тканей. Рассекают кожу эмбриона вдоль боков тела и поперек живота на уровне печени. Переворачивают эмбриона на спину и с помощью тонкого пинцета фиксируют его на месте.

На уровне передних конечностей введите еще один пинцет на уровне диафрагмы, затем резким движением потяните внутренние органы вниз к хвосту и в сторону от дорсальной стенки тела, чтобы удалить внутренности от печени до генитального бугорка. Если какие-либо органы грудной полости, например сердце или легкие, выходят вместе с внутренностями, удалите их перед тем, как продолжить процедуру.

После отделения органов брюшной полости от тушки введите пинцет под печень, рядом с желудком, и аккуратно отделите печень от кишечника. Затем осторожно отделите заднюю кишку от дорсальной уретры и удалите кишечник из мочеполовой системы. В завершение переверните кишечник так, чтобы под желудком стала видна селезенка.

Удалите селезенку и поджелудочную железу. Разведите петли кишечника, удерживая их за брыжейку. Затем осторожно отделите брыжейку и прилегающие сосуды от кишечника, аккуратно потянув за брыжейку.

Избегайте захвата кишечника непосредственно пинцетом. Если кишечник разорвется, просто объедините отдельные фрагменты на этапе диссоциации. Соберите ткани каждого типа в конические пробирки объемом 15 мл, содержащие ледяной HBSS, в соответствии с типом ткани и фенотипом эмбриона.

После центрифугирования и получения осадка из отделенных тканей аспирируют максимально возможный объем HBSS. Затем осадок ткани ресуспендируют в одном или нескольких миллилитрах ACU max, меняя наконечники пипеток для каждого образца.

Чтобы избежать перекрестного загрязнения типов тканей, поместите пробирки в водяную баню при 37 °C на 20–45 минут. В зависимости от стадии выделения ткани, диссоциация и фильтрация являются наиболее сложными этапами процедуры, так как необходимо предотвратить чрезмерную диссоциацию ткани, что в итоге приводит к низкой жизнеспособности клеток.

Ограничьте время диссоциации и не пытайтесь полностью диссоциировать все фрагменты ткани на промежуточном этапе. По истечении времени диссоциации раздробите ткань вручную, с силой ударив пробиркой о стенку водяной бани и резко встряхнув ее резким движением кисти. Перенесите диссоциированные образцы на лед и немедленно добавьте в каждую пробирку 1 mL свежеприготовленного стоп-реагента, используя для каждого образца новый наконечник пипетки; перемешивайте образец путем пипетирования до почти полного распада ткани.

Теперь, используя пару стерилизованных в этаноле пинцетов, поместите квадрат из нейлоновой сетчатой мембраны размером 3 см с размером ячеек 38 мкм на горлышко новой конической пробирки объемом 15 мл. Затем с помощью наконечников с узким отверстием профильтруйте раствор каждой ресуспендированной клетки через сетку, перенося жидкость пипеткой в центр мембраны. После фильтрации клеточной суспензии промойте пробирку с образцом 1 мл раствора quench 1:5 и профильтруйте оставшиеся клетки.

Затем снимите мембрану, стараясь не допустить попадания нефильтрованных образцов ткани в пробирку. После центрифугирования для осаждения клеток аспирируйте супернатант из клеточных суспензий и ресуспендируйте осадок в одном миллилитре раствора quench 1:5. Затем профильтруйте каждую клеточную суспензию через нейлоновую сетку в полистироловые пробирки объемом 5 мл, как показано далее.

Начните с того, что отберите небольшую аликвоту флуоресцентного образца для компенсационного контроля только по EGFP. Затем разделите образец ткани дикого типа на две части, пометив одну как «только дикий тип», а другую как «только seven A a d». Теперь заполните все пробирки с образцами Quench 1–5 и после центрифугирования образцов аспирируйте весь супернатант из каждой пробирки, кроме последних 200 µL.

Наконец, добавьте 7-AAD в образцы, подлежащие сортировке, и в контрольный образец, содержащий только 7-AAD. Затем добавьте 0,75 мл triazole LS в микроцентрифужные пробирки для сбора образцов объемом 1,5 мл. Начните с использования контрольных образцов для настройки параметров компенсации и гейтов, чтобы исключить 7-AAD-положительные мертвые клетки и выделить клетки с высокой интенсивностью флуоресценции GFP.

После настройки параметров компенсации начните сортировку при минимально возможном давлении, используя сопло с широким отверстием и низкую скорость потока. Соберите не более 25 000 клеток в каждую микроцентрифужную пробирку, чтобы избежать чрезмерного разбавления triol LS. Сразу после сортировки перемешайте на вортексе каждую пробирку с клетками, захваченными в triol LS.

На первом рисунке представлен целый препарат половых путей самки европейского кролика на 15,5 день после коитуса, вид снизу при освещении в светлом поле. Тот же образец показан при флуоресцентном освещении для демонстрации распределения EGFP-положительных клеток в надпочечниках и расположенных медиально чревных узлах, идентифицированных по экспрессии трансгена TH EGFP. На данном латеральном виде субдиссекированного мочевого пузыря на 15,5 день после коитуса (линия TH EGFP) видна флуоресценция вследствие экспрессии трансгена в тазовых ганглиях, стенке мочевого пузыря и уретре.

На этом снимке в дорсальной проекции видны те же EGFP-положительные клетки в ткани передней части дорсальной уретры; диссоциация ткани для получения клеточных суспензий для сортинга методом проточной цитометрии требует тонкого баланса между адекватным ферментативным перевариванием и предотвращением избыточного переваривания, которое может привести к низкой жизнеспособности клеток. На этих микрофотографиях показаны ткани кишечника и нижних мочеполовых путей через половину времени диссоциации. Как видно на этих фотографиях надлежащим образом переваритой ткани до и после ручного гомогенизирования, фрагменты субдиссекированных органов все еще четко видны в тканях, которые подвергались ферментативному воздействию слишком долго или при слишком высокой концентрации фермента.

Тем не менее, в полученной суспензии отсутствуют остаточные крупные фрагменты ткани; при надлежащей диссоциации и ручном фильтровании профили проточной цитометрии обычно демонстрируют более 90% жизнеспособных клеток, и в этой жизнеспособной популяции клетки, экспрессирующие репортер, сохраняют высокую интенсивность экспрессии EGFP. Черная популяция состоит из одиночных мертвых клеток, меченных за счет поглощения флуоресцентного красителя 7-AAD. Серая популяция состоит из одиночных клеток, определенных по прямому и боковому светорассеянию, которые не поглотили 7-AAD и, следовательно, являются жизнеспособными.

Зеленая популяция выделена из гейтированной области GFP-положительных событий и состоит из отдельных жизнеспособных клеток, которые исключили семь A a d и демонстрируют флуоресценцию EGFP. С помощью данной процедуры можно проводить изоляцию нейрональных предшественников из других периферических тканей, таких как симпатическая цепь, ганглии задних корешков или легкие, чтобы ответить на вопросы о различиях в профилях экспрессии генов между популяциями или о развитии различных линий.