Очистка и агрегации белка-предшественника амилоида внутриклеточного домена

Целью данной процедуры является очистка внутриклеточного домена белка-предшественника амилоида, также известного как A ICD, а также представление протокола термической агрегации и характеристики A ICD с помощью атомно-силовой микроскопии. Это достигается путем первоначальной экспрессии слитого белка A GST из A ICD в бактериях. Затем белок G-S-T-A-I-C-D очищают и расщепляют тромбином для отделения GST от A ICD, после чего GST удаляют.

Затем индуцируют термическую агрегацию A ICD. Наконец, агрегаты A ICD визуализируют с помощью атомно-силовой микроскопии. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие, что A ICD может быть очищен до гомогенного состояния в количестве, достаточном для биохимического и биофизического анализа.

Основным преимуществом данной методики по сравнению с существующими методами, требующими сложных этапов хроматографии, является получение высокочистого и растворимого ICD. ICD может быть выделен в лабораторных условиях с использованием стандартных реагентов и оборудования. ICD, полученный по данному протоколу, пригоден для дальнейшей биохимической и биофизической характеристики.

Процедуру продемонстрирует Амина ти. Бывший постдок моей лаборатории, доктор Андрес Оберер, покажет, как выполнять визуализацию A ICD с помощью атомно-силовой микроскопии. Для экспрессии рекомбинантного внутриклеточного домена A PP или A ICD начните с клеток BL 21, трансформированных вектором pgx 41, содержащим человеческий A ICD, слитый с C-концом GST; одну колонию инокулируйте в 10 миллилитров бульона LB с ампициллином и инкубируйте в течение ночи при 37 °C при интенсивном перемешивании.

Инкубируйте 400 мл среды LB с ампициллином в колбе объемом один литр, добавив пять мл ночной культуры. Инкубируйте при 37 °C при интенсивном перемешивании до тех пор, пока оптическая плотность при 600 нм не достигнет 0,4–0,6. Обычно это занимает от двух до 2,5 часов; затем индуцируйте экспрессию G-S-T-A-I-C-D.

Мы добавляем 0,4 мМ IPTG и инкубируем при 37 °C при интенсивном перемешивании в течение пяти часов. Центрифугируют клетки при 6 000 ×g в течение 15 минут при 4 °C и хранят осадок при −80 °C. После приготовления буфера для лизиса и охлаждения бактерий на льду к осадку добавляют 20 мл буфера и тщательно перемешивают, сочетая вортексирование и перемешивание пипеткой на льду.

Резьспизируйте бактериальный осадок, затем пропустите резьспизируемый бактериальный лизат через предварительно охлажденный гомогенизатор или пресс Френча. При давлении 30,000 PSI пропустите лизат через гомогенизатор второй раз и соберите лизат в предварительно охлажденную пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте лизат при 15,000 ×g и 4 °C в течение 30 минут.

Отделите и перенесите супернатант в предварительно охлажденную пробирку объемом 50 мл. Добавьте 500 мкл 50% суспензии глетатион-агарозы. Инкубируйте при вращении в течение 30 минут при температуре 4 °C.

После инкубации приготовьте свежий элюирующий буфер. Перенесите лизат и суспензию в одноразовую пятидюймовую полистирольную хроматографическую колонку с фильтрами с крупными порами. Промойте колонку пять раз тремя миллилитрами PBS.

Закройте нижний конец колонки заглушкой и добавьте 500 µL элюирующего буфера комнатной температуры. Закройте верхний конец колонки заглушкой и вращайте в течение пяти минут при комнатной температуре. Соберите первую фракцию в охлажденную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.

Повторите элюцию еще дважды. Диализируйте элюат в диализной мембране с пределом отсечения 10 000 Да в четырех литрах PBS в течение ночи при температуре четырех градусов Цельсия. На следующий день проведите диализ против дополнительных четырех литров PBS при температуре четырех градусов Цельсия в течение одного часа.

Извлеките белок из диализного кассета и проведите количественный анализ белка, чтобы определить выход G-S-T-A-I-C-D. Типичная очистка из 400 milliliters культуры позволяет получить более 20 milligrams очищенного белка с концентрацией от 10 до 20 milligrams per milliliter. Разделите белок на аликвоты по 200 microliter и заморозьте при температуре minus 80 degrees Celsius.

Для высвобождения A ICD из GST-слияния возьмите 200 µL очищенного G-S-T-A-I-C-D и добавьте 20 µL тромбина в концентрации 1 unit/µL; инкубируйте в течение ночи при 37 °C. На следующий день удалите весь агрегированный материал путем центрифугирования при 20 000 ×g в течение 30 минут при 4 °C. Перенесите супернатант в предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку для удаления GST и тромбина. Добавьте 50 µL 50% суспензии глутатион-сефарозы и 50 µL 50% суспензии p-винозиан-сефарозы соответственно.

Инкубируйте при перемешивании в течение пяти минут при комнатной температуре. Кратковременно центрифугируйте для осаждения агробисеров и перенесите супернатант в новую пробирку. Повторите экстракцию GST еще четыре раза с использованием глутатиона.

Арос выполняют количественное определение белка в пяти µL очищенного A ICD. Типичный выход из культуры объемом 400 мл составляет от 50 до 100 мкг при концентрации от 0,2 до 0,5 мг/мл. После разведения свежеприготовленного A ICD в PBS до концентрации 0,1 мг/мл индуцировали термическую агрегацию путем инкубации образцов при 43 °C и 800 об/мин в термошейкере в течение 48 часов.

Разбавьте образец в 20 раз деионизированной водой и нанесите две µL на свежерасщепленную слюду. Высушите образец в эксикаторе в течение ночи для визуализации агрегатов Aβ. Используйте атомно-силовую микроскопию в режиме постукивания с золотым покрытием нитрид-циркониевых кантилеверов с номинальным радиусом острия 2 нм.

Типичные амплитуды постукивания при получении изображений составляют от 10 до 20 нанометров на резонансной частоте кантилеверов. Здесь показаны экспрессия и относительное обогащение G-S-T-A-I-C-D. После лизиса большая часть слитого белка находится в растворимой фракции, поэтому экстракция из телец включения не требуется.

Материал, элюированный с колонки с глутатион-S-фасфотрансферазой, имеет чистоту более 95%. В данной подготовке концентрация белка, элюированного с колонки, составила 14,5 mg/ml, а выход составил 22 mg. Расщепление 200 µL данной подготовки в течение ночи с использованием 20 ед. тромбина привело к почти 100% расщеплению химерного белка.

Количество используемого тромбина достаточно мало, чтобы оно не определялось окрашиванием кумасси. Синее окрашивание, удаление тромбина и GST привели к некоторой потере материала. Тем не менее, чистота составила более 90%, а выход в данной подготовке составил 70 µg A ICD при концентрации 0,35 mg/mL.

Агрегаты ICD, визуализированные с помощью AFM, обычно имеют аморфную стероидную структуру и варьируются по размеру от 50 до 100 nanometers. Агрегированный материал не обнаруживается при добавлении эквимолярного количества шаперона UBI Quillin one в реакцию агрегации. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как очищать EICD, индуцировать его агрегацию и визуализировать агрегаты с помощью AFM EICD.

Продукты, очищенные данным методом, могут быть использованы в других анализах, таких как методы светорассеяния и фильтрационного захвата, для изучения влияния молекулярных шаперонов на агрегацию EACD.