Многоцелевой параллельный подход для обработки Гена на элемент структуры Определение гриппа с использованием полимеразной PB2 субъединицы

Общая цель данного эксперимента заключается в использовании многоцелевого подхода для структурированного определения белка-мишени методом рентгеновской кристаллографии, начиная с одного гена или генетической последовательности, как в представленном здесь случае. Бельком-мишенью является субъединица PB2 полимеразы вируса гриппа А, ключевой компонент репликации вируса. Многоцелевой подход реализуется путем параллельного проектирования и клонирования серии генетических конструкций на основе единственной целевой последовательности и другой известной информации о белке.

Вторым этапом является проверка уровней экспрессии для каждого конструкта и выбор наиболее подходящих из них для крупномасштабной экспрессии белков в клеточной культуре. Следующий этап требует лизиса клеток для выделения целевых белков из экспрессионного материала и очистки каждого из них до очень высокой степени чистоты. Затем для каждого белка проводится серия экспериментов по кристаллизации с целью получения кристаллической формы, подходящей для рентгеноструктурного анализа.

Затем собираются данные рентгеновской дифракции высокого разрешения для одного или нескольких кристаллов, которые используются для решения и уточнения карты электронной плотности, очерчивающей структуру каждого целевого белка. Эти результаты позволяют построить трехмерную структуру целевого белка на основе карты электронной плотности. Параллельная обработка нескольких мишеней значительно повышает вероятность успешного определения структуры, обеспечивая наличие жизнеспособных альтернатив на каждом потенциальном этапе затруднения в процессе исследования.

Параллельная работа с несколькими мишенями также весьма эффективна, так как позволяет сократить время и затраты на каждый белок на каждом этапе. Потенциал ускорения определения структуры доступных для воздействия лекарственных мишеней позволит увеличить количество возможностей для разработки терапии в год. Хотя данный метод может дать ценную информацию в области структурной биологии, высококачественные белки, полученные этими способами, могут быть использованы в любом исследовании на основе белков.

Каждый этап процесса имеет свою научную основу и требует соответствующих экспертных знаний, однако инвестиции в персонал, оборудование и ноу-хау могут полностью оправдаться после объединения всех компонентов. После выбора целевого гена и продукта гена для исследования первым шагом становится разработка множества генетических вариантов или конструкций. Для проектирования этих конструкций на уровне белка, а также соответствующего кода модифицированных последовательностей синтетических генов, используется программное обеспечение для композиции генов.

Используя модуль просмотра выравнивания и модуль конструирования, сравните выравнивания белковых последовательностей и определите дизайн белковых конструкций, вставки ПЦР и терминальные праймеры или адаптеры векторной ПЦР. Затем используйте алгоритм преобразования белка в ДНК в gene composer для обратного перевода каждой аминокислотной последовательности в соответствующую искусственно созданную последовательность нуклеотидов. Используйте соответствующую таблицу кодонов для оптимизации последовательности для экспрессии в конкретной клеточной линии.

В данном случае используются бактерии e coli. После подготовки последовательности целевого гена проведите виртуальное клонирование и вставьте ген в подходящий векторный плазмид для бактериальной экспрессии. В данном примере используется модифицированный вектор PET 28.

Этот вектор содержит определенные компоненты, необходимые для экспрессии и очистки белков. Целевой ген модифицирован таким образом, чтобы включить последовательность гистидинового тега на N- или C-конце белка, а также последовательность сайта расщепления для удаления тега в процессе очистки. Вектор также содержит ген устойчивости к антибиотикам для проверки экспрессии и ферментации.

Затем каждая генетическая последовательность целевого белка создается стандартными методами синтеза генов для подготовки к клонированию посредством полимеразного неполного первичного удлинения (PIPE-клонирование). PIPE-клонирование представляет собой стратегию клонирования на основе ПЦР, при которой целевой ген амплифицируется с помощью праймеров, комплементарных выбранному вектору. Этот метод использует особенность неполного синтеза на поздних стадиях ПЦР, в результате чего продукты ПЦР имеют вариабельные одноцепочечные концы. Я готовлю ПЦР-вставку (IPCR), добавляя по 5 µL прямого и обратного праймеров в каждую реакционную смесь.

В 96-луночный планшет, в соответствии со схемой планшета, добавьте по 2 µL каждого полноразмерного синтетического гена в соответствующую лунку. После добавления 25 µL мастер-микса PFU в каждую лунку проведите 25 циклов реакции, используя следующие условия ПЦР. Денатурация при 95 °C в течение 30 секунд.

Денатурация при 50 °C в течение 45 секунд и элонгация при 68 °C в течение трех минут. Амплификация фрагментов подтверждается анализом продуктов IPCR с помощью гель-электрофореза AGROS. Успешные продукты IPCR характеризуются выраженными полосами.

Менее желательные результаты часто проявляются в виде слабых полос или шлейфов в отдельной реакции. Плазмида экспрессии амплифицируется с помощью векторной ПЦР (VPCR) или амплификация фрагмента VPCR подтверждается гель-анализом продуктов VPCR методом AROS. После амплификации продуктов IPCR и VPCR их добавляют на объединяющую планшету и помещают в термоциклер для проведения реакции объединения.

Затем успешно клонированные конструкции трансформируют в химически компетентные клетки e coli и хранят в глицериновых стоках для начала серии тестов на экспрессию. Небольшое количество каждого образца из глицеринового стока клонированной конструкции высевают на отдельную чашку с агаром. Чашку готовят с использованием бактериального питательного бульона и антибиотика канамицина, кодируемого в векторе, и инкубируют в течение ночи при 37 °C.

Подготовьте предварительную культуру для каждого образца, выбрав одну колонию с недавно выращенной чашки с агаром. Используйте эту колонию для инокуляции 1,2 milliliters бульона TB с добавлением канамицина и глюкозы для параллельной обработки. Каждую предварительную культуру выращивают в 96-луночном блоке с круглым дном.

Инкубируйте в течение ночи при 37 °C с перемешиванием при 220 об/мин. После ночного роста создайте культуры для малого масштаба индукции для каждого образца, используя 40 µL прекультуры для инокуляции.

1,2 миллилитра бульона TB, дополненного канамицином в концентрации 50 мг/мл и системой Novagen Overnight Express. 1. Выращивайте индуцированные культуры при 20 °C в течение 48 часов при перемешивании со скоростью 220 об/мин; соберите клетки путем центрифугирования при 4 000 g в течение 15 минут.

Слейте супернатант и храните осадки при температуре -20 °C не менее одного часа перед дальнейшей обработкой после очистки. Проанализируйте белок с проведением и без проведения реакции расщепления методом капиллярного электрофореза с использованием системы Caliper Lab CHIP 90 в соответствии с протоколом производителя. В случае с белком PB2 вируса гриппа А из 34 конструкций 14 привели к получению растворимого целевого белка и были допущены к следующему этапу — крупномасштабному ферментированию.

Для начала крупномасштабного ферментирования инокулируйте 100 мл бульона с культурой бактериальных клеток, содержащего 50 мг/мл канамицина, из глицерированного стока и инкубируйте в течение ночи при 37 °C при перемешивании со скоростью 220 об/мин. На следующий день расширьте прекультуру, используя 10 мл для инокуляции.

Один литр бульона, содержащего автоиндукционную среду и 50 mg/mL канамицина, в двухлитровой колбе с бафлами. Инкубируйте расширенные культуры при 37 °C с перемешиванием примерно каждые 30 минут. Проверяйте оптическую плотность культуры, измеряя поглощение в УФ-диапазоне при длине волны 600 nm.

При достижении оптической плотности 0,6 по истечении желаемого времени роста измените температуру в встряхивающем инкубаторе на 20 °C. Для проверки экспрессии отберите репрезентативную аликвоту объемом 10 мл из каждого конструкта. Соберут клетки путем центрифугирования при 5 000 ×g в течение 15 минут.

Слейте супернатант и заморозьте осадок клеток при температуре -80 °C. Для начала данной процедуры разморозьте и ресуспендируйте клеточную пасту в лизирующем буфере в соотношении одного объема осадка к пяти объемам буфера. Интенсивно перемешивайте в течение 30 минут при температуре 4 °C.

С помощью чистого шпателя отделите прилипшие к стенкам стакана фрагменты. Механически лизируйте клетки на льду с помощью ультразвукового гомогенизатора. Очистите сырой лизат путем центрифугирования при 18, 000 GForce в течение 30 минут при температуре четырех градусов Цельсия.

Соберите супернатант и сохраните небольшую аликвоту для анализа перед переходом к крупномасштабной очистке. Подтвердите экспрессию белка в каждой культуре в большом масштабе с помощью анализа в геле SDS-PAGE. Этот репрезентативный результат SDS-PAGE демонстрирует интенсивную экспрессию белка, растворимость примерно 50% и расщепление около 50%.

В данном случае гистидиновый тег был удален вместе с дополнительным тегом растворимости белка, который был введен в исходную конструкцию. Никелевая смола используется для отделения целевого белка с уникальным гистидиновым тегом от всего остального клеточного материала, включая нативные белки бактерий. Колонку с никелем подготавливают путем промывки четырьмя объемами колонки деионизированной водой для удаления буфера для хранения, затем одним объемом колонки буфера B и пятью объемами колонки буфера.

Параллельное уравновешивание буферами A и E выполняется с помощью белкового аппарата, позволяющего одновременно обрабатывать несколько колонок. Загрузите каждый осветленный лизат, содержащий сольбубилизированный белок с гистаминовым тегом, в отдельную колонку со скоростью 2 мл/мин, после чего проведите несколько промывок объемом колонки буфером A, соберите проскок буфера и сохраните его для анализа. Элюируйте связанный белок серией ступенчатых градиентов с использованием буферов A и B в соотношениях 95:5, 60:40 и, наконец, 100% буфера B. Компоненты буфера B конкурируют с гистамином за никелевый сорбент и таким образом удаляют белок из колонки при заданном соотношении.

Собирайте каждую фракцию элюции в отдельные пробирки. Здесь представлен репрезентативный результат хроматограммы после пропускания через колонку с Ni-NTA. Проанализируйте фракции, элюированные с колонки с Ni-NTA, неочищенный лизат, осветленный лизат и проскок через колонку с Ni-NTA с помощью SDS-PAGE и сравните результаты с данными поглощения УФ-излучения при 280 нм, полученными в процессе очистки на колонке.

На данном этапе определяется успешность очистки. Выберите и объедините фракции, содержащие целевой белок, для их дальнейшей обработки. Рассчитайте общее количество белка на этой стадии, используя теоретический коэффициент экстинкции белка, измерив поглощение в УФ-области при 280 нанометрах и учитывая общий объем объединенных фракций.

Сохраните небольшую пробу для анализа. Ген целевого белка был закодирован специфической последовательностью, которую ULP one распознает как сайт расщепления, поэтому добавление ULP one приводит к расщеплению между гистидиновым тегом и интересующим белком. Для начала этой процедуры добавьте один микролитр убиквитин-подобной протеазы one на каждые пять миллиграммов белка, присутствующего в объединенных фракциях.

На этом этапе расщепленный белок переносят из буфера B в буфер A для дальнейшей обработки с помощью диализных трубок; белок диализируют против двух литров буфера A в течение четырех часов при температуре четырех градусов Цельсия с перемешиванием. Для PB two после диализа используйте порог отсечения по молекулярной массе 10 килдольтон. Проведите еще один SDS-PAGE гель целевого белка в присутствии и в отсутствие ULP one.

Это позволит определить, прошло ли расщепление ULP1 успешно, и выбрать лучшие фракции для дальнейшей обработки. Здесь представлены репрезентативные результаты электрофореза в ПААГ с SDS для трех конструкций полимеразы pb. Маркеры молекулярной массы двух субъединиц находятся в первой дорожке.

Дорожки две, шесть и 10 содержат объединенные фракции белков с колонок с никелем 1. Дорожки три, семь и 11 содержат проскок расщепленного белка в буфере A с колонки с никелем 2, а дорожки четыре, восемь и 12 демонстрируют удаление гистамидинового тега в буфере B с колонки с никелем 2.

После удаления гистамина объединенные фракции из второй колонки с никелем концентрируют. Для начала эксклюзионной хроматографии (SEC) необходимо снова подобрать подходящий сорбент, исходя из молекулярной массы целевого белка. В данном случае используется колонка Superdex 200 10/300 GL, которую уравновешивают 200 мл буфера для SEC при скорости потока 0,5 мл/мин. С помощью шприца объемом 5 мл образец вводят в петлю для проб объемом 10 мл и запускают процесс SEC. Сбор фракций малого объема проводят, контролируя УФ-хроматограмму при 280 нм.

Проанализируйте все соответствующие фракции SEC с помощью SDS-ПАГ. Стандартный подход к подбору условий кристаллизации белка осуществляется методом сидячей капли с использованием пародиффузии. Зачастую для каждого целевого белка на начальном этапе устанавливают два или более разреженных матричных скрининга.

Для начала этого процесса заполните каждый резервуар 96-луночного компактного планшета для кристаллизации junior 80 мкл соответствующих условий выбранного скрининга кристаллизации; в каждую из 96 лунок внесите 0,4 мкл белка в буфере SEC. Затем добавьте 0,4 мкл раствора из скрининга кристаллизации, обеспечив полное перемешивание капли в каждой лунке. Закройте весь планшет прозрачной герметизирующей лентой, обеспечив полную герметичность каждой лунки; храните планшет при 16 °C в месте, защищенном от внешних вибраций.

В течение следующих нескольких недель периодически проверяйте наличие кристаллов белка под диссекционном микроскопе. Если кристаллы белка не появились, подготовьте новые планшеты с другими условиями и измените концентрацию белка в конечной капле, чтобы повысить вероятность успеха перед сбором. Охладите контейнер типа ALS в сосуде, заполненном жидким азотом, и закройте его крышкой, чтобы начать сбор.

Отрежьте прозрачную ленту, покрывающую лунку с кристаллом целевого белка, и перенесите её на соседнюю пустую лунку. Добавьте 1,6 µL соответствующего осаждающего раствора и смешайте его с 0,4 µL этиленгликоля. Раствор 20% этиленгликоля в осаждающей смеси защищает кристалл белка.

Во время криозаморозки проанализируйте кристалл под микроскопом и выберите подходящую криопетлю для сбора, подобрав внутренний диаметр петли по максимальной ширине кристалла. Закрепите криопетлю на магнитном держателе для кристаллов и захватите кристалл непосредственно из раствора в лунке. Сразу после этого окуните криопетлю с собранным кристаллом в криопротектор, а затем поместите в пук типа LS.

Для мгновенного замораживания кристаллов повторите процедуру для желаемого количества образцов. После завершения сбора используйте манипулятор для puck-контейнера, чтобы установить магнитную крышку на контейнер с мгновенно замороженными кристаллами с согнутыми язычками. Переверните контейнер вверх дном для выполнения следующего шага.

Прикрутите толкатель к шайбе, затем перенесите шайбу в устройство KU actor doer и с его помощью сбейте крышку. Кристаллы в шайбе остаются замороженными в бане с жидким азотом до начала исследований методом рентгеновской дифракции с использованием программного обеспечения для сбора данных J Director. Установите следующие параметры для скрининга кристаллов: ширина щели пучка 0,5 градуса, расстояние до детектора 50 мм, шаг изображения 70 градусов и время экспозиции 30 секунд.

Ниже представлен пример скриншота из программного обеспечения для сбора изображений в процессе скрининга кристаллов; на центральной панели показана рентгеновская дифракция от репрезентативного кристалла, позволившего собрать достаточное количество изображений с высоким разрешением для формирования полного набора данных, необходимого для определения трехмерной структуры. Стратегии клонирования и очистки белков, продемонстрированные в данном видео, позволили получить 14 образцов очищенного PB two, из которых девять дали кристаллы, пригодные для дифракционных исследований. Собственный набор данных рентгеновской дифракции был собран для пяти из девяти конструктов с использованием излучения QK alpha на рентгеновском генераторе с вращающимся анодом Rigaku Super Bright FRE Plus, оснащенном оптикой Ossec Variax HF и CCD-детектором Saturn 944 Plus.

Здесь представлена дифракционная рентгеновская картина субъединицы PB2 полимеразы. Каждый набор данных был обработан, в результате чего было определено в общей сложности четыре структуры субъединицы PB2. Каждая структура прошла экспертную оценку и была загружена в Protein Data Bank для открытого доступа.

На данном рисунке представлены ленточные диаграммы молекул в кристаллографической асимметричной единице. Для двух структур PB2 из четырех вторичные структуры окрашены в радужный цвет с соответствующими кодами PDB. В этой таблице приведен анализ результатов для мишеней PB2 вируса гриппа, полученный с помощью методов, описанных в данной видеостатье.

Многоцелевой конвейер параллельной обработки для определения структуры гена на основе его последовательности проиллюстрирован в пяти этапах: клонирование, определение растворимости, очистка, кристаллизация и определение структуры. Результаты нашего конвейера структурной биологии не только создают основу для исследований структуры, но и служат базой для дополнительных исследований, таких как функциональные анализы для подтверждения функции белка или биофизический скрининг новых соединений с помощью MAR или SPR для поиска новых отправных точек при разработке лекарственных средств. Этот метод и созданные вместе с ним инструменты помогли расчистить путь структурным биологам для проведения многих видов поисковых исследований, включая разработку лекарств на основе структуры, что оказало огромное влияние на здоровье людей и борьбу с заболеваниями.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как многоцелевая параллельная обработка может значительно повысить вероятность успеха при определении структуры. Не забывайте, что работа в лаборатории структурной биологии может быть крайне опасной, поэтому при проведении лабораторных работ следует всегда соблюдать надлежащие меры предосторожности, такие как использование СИЗ.