Компактный квантовых точек для одиночных молекул изображений

Общая цель данной процедуры — подготовить флуоресцентные квантовые точки с оптимизированной яркостью и стабильностью, а также минимальным размером и низкой неспецифической связью для использования в визуализации отдельных молекул. Это достигается путем первоначального синтеза ядер квантовых точек из селенида кадмия. На втором этапе эти ядра легируют ртутью, чтобы сместить их флуоресценцию в красную область спектра и увеличить их яркость.

Затем на нанокристаллах выращивают тонкую оболочку из сплава для стабилизации их флуоресцентного излучения. Заключительным этапом является перенос этих частиц из органических растворителей в водные буферы с помощью многодентатного полимера, который может быть модифицирован биологически инертным полиэтиленгликолем. В конечном итоге с помощью флуоресцентной спектрометрии, гель-хроматографии и гель-электрофореза демонстрируется, что данные частицы обладают яркой флуоресценцией, компактным гидродинамическим размером и нейтральным электростатическим зарядом — характеристиками, которые хорошо подходят для флуоресцентного имиджинга одиночных молекул в биологии.

Основным преимуществом этих квантовых точек по сравнению с существующими коммерческими материалами является значительно меньший гидродинамический размер данных наночастиц. Хотя меньшие квантовые точки подвержены негативному влиянию в виде снижения интенсивности флуоресценции, уменьшения стабильности флуоресценции и свечения только в синем спектре, мы компенсировали эти эффекты с помощью процесса катионного обмена ртутью. Эти нанокристаллы могут помочь ответить на ключевые вопросы биофизики и клеточной сигнализации, обеспечивая динамическую визуализацию отдельных биомолекул в плотных биологических средах.

Для начала приготовьте 0,4 молярный раствор селена в топ, добавив селен в трехгорлую колбу объемом 50 мл, откачав воздух из колбы с помощью высокого вакуума и заполнив ее аргоном с использованием линии Шленка в бескислородных условиях. Добавьте 10 мл топ и нагрейте до 100 °C при перемешивании в течение одного часа до получения прозрачного бесцветного раствора.

Охладите раствор до комнатной температуры и отставьте колбу в сторону. Также приготовьте раствор оксида кадмия, TDPA и ODE в трехгорлой колбе объемом 250 миллилитров, используя количества, указанные в письменном протоколе, сопровождающем данное видео; удалите воздух из раствора с помощью вакуумной линии при перемешивании.

Повысьте температуру до 100 °C и проведите вакуумирование в течение еще 15 минут. Чтобы удалить примеси с низкой температурой кипения в атмосфере аргона, нагрейте смесь до 300 °C в течение одного часа для полного растворения оксида кадмия. Раствор изменит цвет с красноватого на прозрачный и бесцветный; охладите раствор до комнатной температуры.

Затем добавьте HDA в раствор кадмия, нагрейте до 70 °C и откачайте воздух. После достижения стабильного давления повысьте температуру и кипятите раствор с обратным холодильником в течение 30 минут. Переключите кран линии Шлинка на подачу инертного газа и введите термопару непосредственно в раствор.

В условиях отсутствия воздуха добавьте DPP к раствору кадмия и поднимите температуру до 310 °C. Затем с помощью одноразового пластикового шприца с иглой 16G отберите 7,5 мл 0,4 M верхнего слоя раствора селена. Как только температура стабилизируется на уровне 310 °C, установите контроллер температуры на 0 °C и быстро введите раствор селена непосредственно в раствор кадмия.

Раствор изменит цвет с бесцветного на желтый, затем на оранжевый, при этом температура быстро упадет, а затем снова поднимется примерно до 280 °C. Самым сложным этапом данной процедуры является максимально быстрое введение всего объема шприца в раствор кадмия. Это обеспечивает гомогенное зарождение частиц.

После одной минуты реакции извлеките колбу из heating mantle и быстро охладите струей воздуха, пока температура не опустится ниже 200 °C. Когда температура достигнет примерно 40 °C, разбавьте смесь 30 мл гексана; большая часть оставшегося прекурсора кадмия выпадет в осадок. Удалите этот осадок путем центрифугирования.

В каждой из шести конических полипропиленовых центрифужных пробирок объемом 50 мл разбавьте 12 мл полученного исходного раствора нано-Krystal. Добавьте 40 мл ацетона, после чего проведите центрифугирование с теми же параметрами, осторожно слейте и удалите супернадант. Затем растворите осадок нано-krysttal в гексане.

Экстрагируйте раствор равным объемом метанола, сохранив верхнюю фазу. Повторите экстракцию еще дважды (всего три раза). Объем метанола можно скорректировать примерно до 15 мл, чтобы получить концентрированный гексановый раствор чистых квантовых точек селенида кадмия с концентрацией около 200 µM.

Типичным выходом данной реакции являются кристаллы селенида кадмия с концентрацией 3 µM и диаметром 2–3 нм. Определите диаметр и концентрацию нанокристаллов путем измерения спектра поглощения в ультрафиолетовой и видимой областях, как описано в письменной процедуре. Для смещения поглощения и флуоресцентной эмиссии в красную область нанокристаллы могут быть частично заменены ртутью. Для этого в стеклянном флаконе объемом 20 мл с магнитной мешалкой смешайте гексан и хлороформ, затем добавьте раствор квантовых точек селенида кадмия в OLA и октанатом ртути. После очистки нанокристаллов и определения их концентрации, согласно письменной процедуре, оставьте нанокристаллы выдерживаться при комнатной температуре не менее чем на 24 часа для роста оболочки.

Приготовьте 0,1 М растворы предшественников оболочки в трехгорлых колбах объемом 50 мл; в вакууме нагрейте растворы предшественников кадмия, цинка и серы с обратным холодильником в течение одного часа до получения прозрачных растворов, затем заполните трехгорлую колбу аргоном. Добавьте TOPO, ODE и приготовленные квантовые точки селенида кадмия-ртути. Удалите гексин при комнатной температуре с помощью вакуумной линии.

Повысьте температуру до 100 °C и кипятите с обратным холодильником в течение 15 минут. Переключите линию подачи газа на аргон и поместите термопару в раствор nano Krystal. После повышения температуры до 120 °C добавьте 0,5 монослоя или 140 µL раствора предшественника серы и дайте реакции протекать в течение 15 минут.

Увеличьте температуру до 140 °C. Добавьте 0,5 монослоев или 140 µL раствора предшественника кадмия и дайте реакции протекать в течение 15 минут. Затем добавьте в реакционный раствор 500 µL безводного OLA.

При 160 °C добавьте 0,5 монослоев или 220 µL раствора предшественника серы, затем такое же количество раствора предшественника цинка при 170 °C с интервалом в 15 минут между каждым добавлением. Затем при 180 °C добавьте 0,25 монослоев или 150 µL раствора предшественника серы и раствора предшественника цинка с интервалом в 15 минут. Охладите раствор до комнатной температуры и определите новый коэффициент экстинкции для этих частиц.

Используя УФ-видимый спектр и предполагая, что количество нанокристаллов не изменилось, храните раствор реакционной смеси в виде неочищенного продукта в морозильной камере. На данном этапе нанокристаллы могут быть охарактеризованы с помощью электронной микроскопии, УФ-видимой абсорбционной спектроскопии и флуоресцентной спектроскопии. Перенесите очищенные квантовые точки «ядро-оболочка» в трехгорлую колбу объемом 50 мл и удалите гексан в глубоком вакууме.

Для получения сухой пленки заполните колбу аргоном. Добавьте безводный пурин к пленке из наночастиц и нагревайте суспензию до 80 °C в течение одного-двух часов. Наночастицы полностью растворятся.

Добавьте один миллилитр 1 M глицерина в раствор и перемешивайте при 80 °C в течение двух часов. После охлаждения раствора до комнатной температуры добавьте 0,5 мл триэтиламина для депротонирования тиоглицерина и перемешивайте в течение 30 минут. После добавления триэтиламина раствор может стать мутным из-за низкой растворимости полярных нанокристаллов в данной смеси растворителей.

Перенесите раствор квантовых точек в коническую центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую смесь 20 миллилитров гексана и 20 миллилитров ацетона, и тщательно перемешайте. Выделите осажденные нанокристаллы путем центрифугирования, затем промойте осадок ацетоном, растворите осадок квантовых точек в пяти миллилитрах DMSO с помощью ультразвуковой бани и повторно центрифугируйте. Для удаления возможных агрегатов определите концентрацию наночастиц по спектру поглощения в УФ-диапазоне.

Раствор чистых квантовых точек следует использовать в течение трех часов, так как их поверхность может медленно окисляться при воздействии воздуха в окружающих условиях. Разбавьте раствор квантовых точек с помощью DMSO до концентрации 10 micromolar или ниже и перенесите его в колбу объемом 50 milliliter. При перемешивании по каплям добавьте к раствору квантовых точек приготовленный раствор разбавленной полиакриловой кислоты в DMSO с концентрацией 5 mg/mL, затем дегазируйте раствор при комнатной температуре в течение пяти минут.

Продуйте раствор полимера с квантовыми точками аргоном и нагрейте до 80 °C на 90 минут. После охлаждения раствора до комнатной температуры по каплям добавьте равный объем 50 мМ раствора натриевой соли при pH 8 и перемешивайте в течение 10 минут. Очистите квантовые точки согласно описанной письменной процедуре и определите их концентрацию по спектру УФ-видимого поглощения. В стеклянном флаконе объемом 4 мл с перемешивающим элементом смешайте 1 моль квантовых точек в боратном буфере с 40 000-кратным молярным избытком моноаминополиэтиленгликоля с молекулярной массой 750 Дальтон.

Инструкции по добавлению специфических химических функциональных групп к нанокристаллам приведены в письменном описании процедуры. Быстро добавьте свежеприготовленный раствор активирующего агента в 25 000-кратном молярном избытке к раствору квантовых точек и перемешивайте при комнатной температуре в течение 30 минут. Повторите этот шаг еще четыре раза, чтобы насытить поверхность нанокристаллов PEG.

Наконец, добавьте 200 µL одного молярного Трис-буфера, чтобы остановить реакцию перед очисткой нанокристаллов с помощью диализных центрифужных фильтров или ультрацентрифугирования. Полученные нанокристаллы можно проанализировать на монодисперсность, гидродинамический размер и поверхностный заряд с помощью жидкостной хроматографии, гель-электрофореза и флуоресцентной микроскопии. Здесь представлены типичные спектры поглощения и флуоресценции для нанокристаллов селенида кадмия, нанокристаллов селенида ртути-кадмия после катионного обмена, а также нанокристаллов с ядром из селенида ртути-кадмия и оболочкой из сульфида цинка-кадмия после роста оболочки. Нанокристаллы с ядром из селенида кадмия имеют квантовый выход флуоресценции около 15%. Однако эта эффективность падает до менее 1% после обмена на ртуть, что, вероятно, связано с ловушками носителей заряда, возникающими из-за нарушения структуры поверхностных атомов.

Наращивание тонкой оболочки из сульфида кадмия и цинка повышает эту эффективность до более чем 70%, что в значительной степени сохраняется после переноса в воду. Напротив, нанокристаллы с ядром из селенида кадмия и оболочкой из сульфида кадмия и цинка без включения ртути теряют значительную часть своего квантового выхода в воде, если только не выращена толстая оболочка. Важно отметить, что покрытие сульфидом кадмия и цинка смещает спектры в красную область из-за утечки электронных носителей заряда в материал оболочки.

Этот сдвиг составляет около 20–30 нанометров для ядер из кадмия и увеличивается по мере роста содержания ртути в ядре. Таким образом, за счет включения ртути в нанокристаллическое ядро удается сохранить малый размер нанокристалла без потери яркости. Малый размер продемонстрирован на данной микрофотографии, полученной с помощью просвечивающей электронной микроскопии, и на графике распределения частиц по размерам для нанокристаллов ядро HgCdSe/оболочка CdZnS, средний диаметр которых составляет 3,2 ± 0,6 нанометра.

Использование двухэтапного фазового переноса в воду имеет решающее значение для получения гомогенной популяции нанокристаллов, которая не требует дальнейшей сортировки по размеру для удаления кластеров и агрегатов методом эксклюзионной хроматографии. Представленная здесь хроматограмма подтверждает, что размер аналогичен размеру кональбумина. При значении 75 килодальтон и после модификации амино-ПЭГ массой 750 Да размер увеличивается всего до 12 нанометров, что сопоставимо с размером антитела IgG.

Модификация ПЭГ нейтрализует поверхностный заряд, что подтверждается экспериментом по агарозному гель-электрофорезу, представленным здесь; лунка отмечена стрелкой, а полярность электродов указана справа, что демонстрирует: до конъюгации нанокристаллы мигрируют как заряженные частицы, а ПЭГилированные нанокристаллы электростатически нейтральны. Здесь представлена эпифлуоресцентная микрофотография этих нанокристаллов, осажденных на стеклянный покровное стекло и возбужденных видимым светом с длиной волны 545 нанометров. Эти нанокристаллы легко наблюдаются на уровне отдельных молекул с частотой 30 кадров в секунду с помощью ПЗС-камеры с электронным умножением.

На этом графике показано, что количество флуоресцентных частиц, наблюдаемых в каждом кадре, колеблется с течением времени при непрерывном возбуждении. Это обусловлено сочетанием мигания и фотодеградации. В первые семь минут преобладает мигание, после чего начинает постепенно проявляться окислительная фотодеградация.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как химически синтезировать квантовые точки, как переводить их в водные буферы и как модифицировать их для применения в биовизуализации. Не забывайте, что работа с реагентами, содержащими кадмий и ртуть, может быть чрезвычайно опасной, поэтому следует принять дополнительные меры предосторожности для предотвращения воздействия на организм.