Измерение антител воздействие на клеточные функции кардиомиоцитов изолированного

Общая цель следующего эксперимента заключается в выявлении кардиотропных антител в плазме пациентов с дилатационной кардиомиопатией или другими заболеваниями сердца с аутоиммунным фоном. Это достигается путем предварительной мини-иммуноабсорбции плазмы пациента на колонках со сферами anti IgG для очистки иммуноглобулина G на втором этапе. Вентрикулярные кардиомиоциты изолируют из взрослых крыс линии Wistar, что создает клеточную основу для данного биоанализа.

Затем кардиомиоцитам дают время прикрепиться к покровным стеклам камеры, после чего их окрашивают URA 2:00 AM для обеспечения возможности наблюдения за внутриклеточными транзиентами кальция во время сокращений; далее тестируют IgG пациента, чтобы изучить его влияние на сократительную способность кардиомиоцитов. Результаты позволяют определить, содержит ли IgG пациента тропные антитела, основываясь на изменениях сократимости и транзиентов кальция в изолированных кардиомиоцитах. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими, такими как стандартные иммуноанализы для обнаружения антител, является его независимость от конкретного антигена и возможность дифференцировать стимулирующие и блокирующие антитела.

Демонстрация процедуры была проведена при технической поддержке нашей лаборатории. Чтобы начать эту процедуру, подготовьте мини-иммуноадсорбционные колонки, поместив 3 мл анти-IgG сфер на каждые 2 мл плазмы пациента, собранной в пробирки с ЭДТА, в пустую колонку Econopak. Затем поместите фильтр поверх анти-IgG сфер.

Отрежьте нижний кончик колонки и прижмите фильтр так, чтобы скорость потока составила примерно одну каплю в секунду. Затем трижды промойте колонку одним объемом плазмы 0,9% Sodium chloride. Пипетируйте плазму в колонку; когда плазма полностью пропитает anti IgG Spheros, промойте ее тем же объемом 0,9% sodium chloride. Затем пипетируйте в колонку один объем плазмы 0,2 molar glycine hydrochloride при pH 2.8 и дайте раствору полностью пропитать сорбент.

Затем добавьте в колонку еще один объем гидрохлорида глицина. Соберите элюат в пробирку объемом 15 мл и доведите pH до 7,3 с помощью 0,5 М трис-гидрохлорида с pH 8,0 для регенерации колонки. После окончательной промывки двумя объемами 0,9% раствора хлорида натрия промойте колонку тремя плазменными объемами гидрохлорида глицина.

Колонку можно использовать для следующего образца плазмы для применения на кардиомиоцитах. Собранную фракцию IgG необходимо диализовать против экспериментального буфера: сначала перенесите фракцию IgG в трубку с диализную мембрану из целлюлозного эфира с пределом отсечения по молекулярной массе 100 kilodaltons. Затем поместите трубку в один литр EB и медленно перемешивайте с помощью магнитного перемешивателя при температуре four degrees Celsius. Через восемь часов перенесите диализную трубку в три литра свежего EB и диализируйте еще 20 hours при температуре four degrees Celsius.

Кипятите образец в течение 30 минут при 57 °C на водяной бане. Для инактивации факторов комплемента определите общую концентрацию IgG и приготовьте аликвоты, содержащие по 330 µg IgG каждая. В данной процедуре приготовьте изоляционный буфер без кальция в соответствии с прилагаемой рукописью.

Затем наполните верхний резервуар перфузионной системы thermostat lanor 80 миллилитрами IB, поддерживайте буфер при 37 °C и аэрируйте его смесью 95% кислорода и 5% углекислого газа в течение 30 минут. Растворите примерно 7 000–10 000 единиц коллагеназы второго типа и 174 миллиграмма BSA, не содержащего жирных кислот, в 20 миллилитрах IB, содержащего 112,5 мкМ хлорида кальция, и, при необходимости, отрегулируйте pH буфера для выделения в верхнем резервуаре.

Затем проведите анестезию крысы линии Wistar массой от 175 до 200 г с помощью тиопентала в дозе 375 µg/kg, добавив в раствор тиопентала 2 500 IU гепарина. После торакотомии осторожно извлеките сердце с неповрежденной дугой аорты и перенесите его в ледяной 0% раствор NaCl. Удалите кровь и окружающие ткани из сердца.

Затем перенесите орган в свежий 0,9% раствор хлорида натрия и обнажите аорту. Включите редуктор потока системы Лангора, чтобы добиться скорости капельного подачи от двух до трех капель в секунду. После этого подсоедините сердце к канюле.

Проводите перфузию в течение трех минут при скорости потока одна капля в секунду, чтобы вымыть остатки крови. После этого циркулируйте IB в системе LOR. Затем удалите 20 milliliters буфера из верхнего резервуара.

Заполните резервуар раствором коллагеназы и долейте необходимое количество буфера до достижения объема 80 milliliters. Затем циркулируйте раствор для переваривания еще в течение 27 minutes. После этого отсоедините сердце от канюли.

Удалите предсердия и аорту, затем нарежьте желудочки на мелкие кусочки. Дайте буферу для переваривания стечь в нижний резервуар. Уменьшите объем максимум до 40 milliliters, чтобы продолжить переваривание нарезанных желудочков в течение 10–15 минут при непрерывной аэрации смесью 95%oxygen и 5%carbon dioxide.

Затем профильтруйте клеточную суспензию через марлю с размером ячеек 200 мкм в пробирку объемом 50 мл. В завершение восстановите содержание кальция в клетках, центрифугируя клеточную суспензию при 40 3G в течение двух минут. При комнатной температуре ресуспендируйте клетки в 10 мл.

Пробирку с 200 µM хлорида кальция снова центрифугируют и ресуспендируют клетки в 10 мл. Пробирку с 500 µM хлорида кальция. После окончательного центрифугирования кардиомиоциты ресуспендируют в стерильно отфильтрованной среде EB до плотности 50 000 клеток на мл.

Покройте покровные стекла в четырехлунковой камере ламинином из расчета 10 µg на лунку и дождитесь полного высыхания. Затем внесите по 1 мл суспензии кардиомиоцитов в каждую лунку. Используя микропипетку с обрезанным наконечником, дайте клеткам прикрепиться в течение одного часа при комнатной температуре; разведите 10 µL стокового раствора fira 2:00 AM с концентрацией 1 mg/mL в 5 мл EB-буфера и храните окрашивающий раствор в темноте.

Затем удалите буфер и неприкрепившиеся клетки с покровных стекол, после чего пипеткой внесите по 0.5 мл окрашивающего раствора. Инкубируйте клетки в каждой лунке в течение 10 минут при умеренном перемешивании. Затем удалите окрашивающий раствор и один раз промойте клетки 1 мл eb.

Затем добавьте по 0,5 milliliters EB в каждую лунку в соответствии с данной процедурой, поместите покровное стекло под инвертированный флуоресцентный микроскоп, подключенный к системе регистрации кальция и сократимости миоцитов. Разместите изготовленный на заказ электрод с трубками притока и оттока в первой лунке и перфузируйте кардиомиоциты EB со скоростью один milliliter per minute.

Начните электрическую стимуляцию при напряжении 20 volts, частоте 1 hertz и длительности импульса 5 milliseconds, давая клеткам адаптироваться к стимуляции в течение примерно двух минут. Выберите целый палочковидный кардиомиоцит с четкой исчерченностью и постоянным сокращением и поместите его в центр поля зрения. Затем откройте канал камеры и расположите клетку горизонтально в области видеокадра, вращая адаптер кадрирования клетки и перемещая предметный столик микроскопа.

Отрегулируйте границы детектирующих контрольных элементов видеообласти. Включите флуоресцентный канал и запишите от 10 до 15 сокращений для определения исходного укорочения клеток и кальциевого транзиента. После этого выключите световой канал микроскопа, чтобы избежать выгорания флуоресцентного красителя.

Переключите поток из EB на байпас образца с помощью трехходового клапана и перфузируйте кардиомиоциты одним миллилитром IgG пациента. Остановите насос непосредственно перед тем, как воздух достигнет лунки, затем включите световой канал и проведите запись еще 10–15 сокращений для получения острого клеточного ответа. После этого приостановите запись и снова выключите световой канал; повторите записи через две и пять минут, а по их завершении извлеките электрод из лунки. В конце проанализируйте сокращение клеток и кальциевый транзиент с помощью программного обеспечения IonWizard, используя соответственно окно edge length/length и URA two numeric subtracted/ratio.

Затем рассчитайте процентные изменения для острого ответа, а также ответов через две и пять минут относительно исходного сокращения клетки и пиковой высоты кальциевого транзиента. Ниже приведен репрезентативный пример контрольного измерения. Сокращение клетки и кальциевый транзиент мониторировали в режиме реального времени до суперфузии IgG, а также непосредственно через две и пять минут после суперфузии IgG.

А здесь представлен пример измерения образца IgG, содержащего кардиодепрессивные антитела. Сокращение клетки и переходный процесс кальция измерялись в режиме реального времени до суперфузии IgG, а также непосредственно через две и пять минут после суперфузии IgG. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как выявлять кардиотоксичные антитела в плазме пациента путем измерения влияния изолированного IgG на сокращение клеток и переходный процесс кальция в изолированных кардиомиоцитах взрослых крыс.