Двух-и трехмерных изображений живых клеток ДНК, белков реакции на повреждения
28 сентября 2012 г.
Этот протокол описывает метод визуализации ДНК двухцепочечной перерыв сигнальный белок активируется в ответ на повреждения ДНК, а также его локализации во время митоза.
В данной демонстрации используются 2D- и 3D-визуализация живых клеток для изучения пространственно-временных взаимосвязей белков, участвующих в ответе на повреждение ДНК. Сначала проведите трансфекцию или трансдукцию выбранной клеточной линии экспрессионными конструкциями, содержащими соответствующие флуоресцентные маркеры; в данном случае — mCherry и GFP. Затем запишите серию контрольных видео, демонстрирующих флуоресцентно меченые клетки в нормальных условиях.
Затем примените соответствующее воздействие, зарегистрируйте данные о влиянии этого воздействия на процесс флуоресценции клеток и проанализируйте видеоданные для выявления пространственно-временных взаимосвязей белков. В конечном итоге флуоресцентная микроскопия живых клеток позволяет детально изучить клеточную динамику, например, формирование фокусов 53 BP one в ответ на воздействие агентов, повреждающих ДНК, или поведение 53 BP one во время митоза. Мы впервые заинтересовались 2D- и 3D-визуализацией живых клеток, когда возникла необходимость изучить, как различные воздействия влияют на митоз в определенных клеточных линиях.
Данный экспериментальный подход позволяет изучать ответ на повреждение ДНК и поддержание геномной стабильности проще, чем традиционные методы. Кроме того, этот метод можно использовать для изучения взаимодействия определенных белков в различных сигнальных путях и в различных клеточных линиях. Главное преимущество прижизненной визуализации перед традиционными методами, такими как цитохимия, заключается в возможности изучения белков ответа на повреждение ДНК в режиме реального времени.
Оптимизация подходящих условий записи может быть сложной задачей. Данная демонстрация позволяет ознакомиться с многочисленными мелкими этапами, необходимыми для достижения успеха. Помните, что настойчивость приносит свои плоды, когда речь идет о минимизации фотообесцвечивания, подборе оптимальных интервалов записи, определении подходящей продолжительности записи и так далее.
Проведите трансфекцию или трансдукцию соответствующих клеточных линий плазмидами для экспрессии слитых белков mCherry и GFP. Поддерживайте культуры в условиях селективного давления антибиотиков и за день до получения изображений периодически проверяйте экспрессию флуоресцентных белков. Соберите клетки с помощью трипсина.
Затем высейте культуры с низкой плотностью на стеклянные планшеты с флуоресцентным дном диаметром 3.5 сантиметра. Данный протокол был разработан с использованием спиннинг-дискового конфокального микроскопа Zeiss cell observer SD, оснащенного штативом axio observer Z one. Сначала убедитесь, что подача газа CO2 в модуль CO2 инкубационной системы осуществляется. Если микроскоп установлен на антивибрационном пневматическом столе Airtable, включите подачу воздуха для Airtable.
Теперь включите питание блока вращающегося диска штатива микроскопа, камер, инкубационных модулей, осветителя HXP, моторизованного столика, аргонового лазера и компьютера. Включите переключатели тех линий лазера, которые будут использоваться. Запустите программное обеспечение Axio vision.
Программное обеспечение Avision может быть настроено с помощью окон и выпадающих меню, специфичных для конкретного микроскопа и управляемых им компонентов. Таким образом, каждый пользовательский интерфейс может иметь уникальный вид. Примерно за один час до проведения визуализации найдите элементы управления инкубатором и включите нагрев верхней камеры и предметного столика.
Установите температуру на 37 °C. Включите контроль CO2 и установите его уровень на 5%. Выберите объектив для визуализации в данном исследовании. Для данного объектива требуется использование иммерсионной среды с коэффициентом преломления, близким к показателю преломления воды.
Если вам необходимо проводить визуализацию нескольких позиций в течение длительного времени, убедитесь, что вы нанесли достаточное количество иммерсионной среды, чтобы предотвратить высыхание препарата. Поместите чашку с культурой на предметный столик и с помощью органов управления микроскопом или программного обеспечения подведите объектив до касания с дном чашки. Направьте излучаемый свет в окуляры и выберите соответствующий набор широкопольных фильтров для интересующего вас флуоресцентного сигнала.
Теперь смотрите через окуляры. Сфокусируйте изображение и найдите подходящее поле клеток, используя программное обеспечение или органы управления микроскопа. В программе перенаправьте излучаемый свет от окуляров к порту с блоком конфокального вращающегося диска.
Включите соответствующий лазер для данного исследования. Для каждого канала отрегулируйте интенсивность лазера, установив управление перестраиваемым оптическим фильтром Kuo на подходящий уровень. Затем выберите соответствующее дихроичное зеркало и эмиссионные фильтры.
Откройте затвор блока вращающегося диска. Теперь выберите окно живого просмотра, чтобы отобразить текущее поле зрения. Затем откройте окно управления камерой.
Выберите используемую камеру и установите время экспозиции примерно на 100 миллисекунд. При необходимости отрегулируйте процент усиления и коэффициент усиления EM. Также откройте панель управления блоком конфокального вращающегося диска и настройте скорость вращения диска, введя установленное время экспозиции камеры для получения подходящего изображения.
Нажмите «set», чтобы зафиксировать изменения. Теперь откройте окно многомерного сбора данных. Перейдите на вкладку «channel» и загрузите или выберите соответствующие каналы, определенные для Flora Fours.
Для обеспечения совмещения изображений используйте один и тот же дихроичный зеркальный фильтр для обоих каналов. Установите в программном обеспечении режим автоматической фокусировки. Перейдите в окно MDA и выберите вкладку ZS stack.
Выберите Z-стек в текущем положении фокуса. Установите диапазон Z-стека 10 микрон и выберите оптимальное количество шагов для обеспечения найквистовского сэмплинга по оси Z. Теперь нажмите «старт» и проанализируйте полученное изображение Z-стека. Перейдите на вкладку времени.
Установите интервал между временными точками визуализации и общую продолжительность сессии. Для многоточечной визуализации нескольких клеток в чашке откройте окно MDA. Перейдите на вкладку «Position» (Позиция) и убедитесь, что установлена галочка напротив параметра «apply setting before or after time point per position» (применять настройки до или после временной точки для каждой позиции).
Теперь выберите метку. Используя режим живого просмотра, перемещайте чашку и выбирайте подходящие поля зрения. Нажмите «start» в меню многомерного сбора данных, чтобы начать эксперимент и записать контрольное видео.
Перейдите к добавлению соответствующего препарата и запишите экспериментальное видео с заданными временными интервалами в течение определенного периода времени. Для данной клеточной линии и для мониторинга всего процесса митоза мы использовали интервал семь с половиной минут в течение четырех-пяти часов. Вам потребуется определить конкретные настройки для вашей клеточной линии и в зависимости от того, что именно вы хотите изучить.
Откройте программное обеспечение Velocity, создайте и назовите новую библиотеку, а затем импортируйте файлы экспериментальных видео для их просмотра. Попробуйте использовать настройку расширенного фокуса (extended focus), при необходимости отрегулируйте видео. Velocity оснащена набором инструментов, которые помогают улучшить качество полученных вами изображений.
Правильная настройка микроскопа позволит существенно сэкономить время на последующей обработке данных. Зачастую полезно выполнить деконволюцию изображений, а также отрегулировать яркость и контрастность в соответствии с конкретными задачами вашего эксперимента. Для визуализации клеток в 3D переключитесь на режим прозрачности 3D (3D opacity).
Это позволяет вращать трехмерные модели клеток в пространстве, обеспечивая тем самым просмотр структур, представляющих интерес внутри клеток, с разных ракурсов. Видеоролики и статические изображения могут быть экспортированы в различные типы файлов в зависимости от предпочтений пользователя. По сравнению с контролем, в фибробластах, подвергнутых воздействию CPT, фокусы образовались в течение пяти-10 минут и сохранялись на протяжении всего времени записи.
Примечательно, что в клетках эмбриональной почки человека 53 BP one диссоциирует из хроматина в начале митоза, образуя тонкую дымку вокруг конденсирующихся хромосом. По мере протекания телофазы и завершения митоза 53 BP one снова агрегирует в отчетливые фокусы. Мы надеемся, что это видео позволит вам изучить пространственно-временные взаимосвязи белков, участвующих в ответе на повреждение ДНК, а также других путей.
Например, в области динамики хроматина этот метод использовался для изучения того, как связывание 53 BP1 влияет на движение теломерных концов ДНК. После создания генетически модифицированных клеток 2D- и 3D-визуализация живых клеток может быть выполнена примерно за четыре–восемь часов. Убедитесь, что настройки микроскопа подобраны надлежащим образом для достижения оптимального качества изображений.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан метод визуализации сигнального белка двухцепочечных разрывов ДНК, который активируется в ответ на повреждение ДНК, а также определение его локализации во время митоза. В демонстрации используется 2D- и 3D-визуализация живых клеток для изучения пространственно-временных взаимосвязей белков, участвующих в ответе на повреждение ДНК.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Ответ на повреждение ДНК
- Визуализация живых клеток
Теоретические основы
- Понимание ответа на повреждение ДНК имеет решающее значение для регуляции клеточного цикла.
- Флуоресцентные маркеры помогают визуализировать динамику белков в живых клетках.
- Методы двух- и трехмерной визуализации улучшают пространственный и временной анализ.
- 53 BP1 является ключевым белком, участвующим в ответе на повреждение ДНК.
Цель исследования
- Для визуализации активации и локализации белков сигнального пути повреждения ДНК.
- Для анализа влияния агентов, повреждающих ДНК, на клеточную динамику.
- Для изучения поведения белков во время митоза.
Используемые методы
- Трансфицируйте или трансдуцируйте клеточные линии конструкциями с флуоресцентными маркерами.
- Запишите контрольные видео с флуоресцентно мечеными клетками в нормальных условиях.
- Проведите воздействие и соберите данные об эффектах этого воздействия.
- Проанализируйте видеоданные для выявления пространственно-временных взаимосвязей белков.
Основные результаты
- Флуоресцентная микроскопия живых клеток позволяет выявить динамику формирования фокусов 53 BP1.
- Поведение белков во время митоза зависит от воздействия агентов, повреждающих ДНК.
- Двух- и трехмерная визуализация дает представление о клеточных реакциях на проводимое лечение.
- Можно эффективно анализировать пространственно-временные взаимосвязи белков.
Выводы
- Данный метод позволяет детально наблюдать за белками ответа на повреждение ДНК.
- Визуализация живых клеток является мощным инструментом для изучения клеточной динамики.
- Понимание этих процессов может помочь в разработке терапевтических стратегий борьбы с повреждениями ДНК.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Двумерная (2D) и трехмерная (3D) визуализация живых клеток для изучения белков ответа на повреждение ДНК, таких как 53BP1, позволяет напрямую наблюдать за пространственно-временной динамикой белков после генотоксического стресса. Эта возможность способствует снижению механистических рисков и повышению прогностической уверенности на ранних этапах поиска, особенно для мишеней и путей, участвующих в поддержании геномной стабильности. Интеграция этих методов визуализации помогает в валидации мишеней и принятии решений по сортировке портфеля в программах по онкологии и поддержанию целостности генома.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишеней
- Позволяет в режиме реального времени анализировать активацию путей репарации ДНК и рекрутирование белков.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней DDR посредством визуализации локализации и кинетики белков.
- Способствует снижению механистических рисков за счет выяснения степени вовлечения сигнального пути и клеточного контекста.
- Позволяет с уверенностью прогнозировать результаты при разработке модуляторов DDR или стратегий синтетической летальности.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет создать валидированные системы живых клеток для количественной оценки динамики белков DDR.
- Обеспечивает воспроизводимое измерение формирования фокусов и изменений хроматина после обработки.
- Способствует стандартизации анализа для скрининга соединений, воздействующих на пути репарации ДНК.
- Позволяет масштабировать адаптацию метода для различных клеточных линий и генетических backgrounds.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет результаты визуализации с релевантными для заболевания моделями геномной нестабильности.
- Обеспечивает преемственность от этапа открытия до доклинической валидации агентов, воздействующих на DDR.
- Позволяет осуществлять продвижение с учетом рисков, связывая механистические показатели с трансляционными конечными точками.
- Поддерживает разработку биомаркеров для оценки активации путей DDR.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод визуализации применяется на стыке этапов первичного поиска и идентификации соединений-лидеров, обеспечивая как валидацию мишеней на основе гипотез, так и последующую разработку анализов для программ, сфокусированных на DDR.
- Фундаментальная биология: Визуализация рекрутирования белков и ремоделирования хроматина в ответ на повреждение ДНК, что позволяет прояснить функции соответствующих сигнальных путей.
- Скрининг: Обеспечение количественных и воспроизводимых показателей формирования фокусов белков DDR для оценки соединений.
- Аналитика: Возможность измерения пространственно-временной динамики белков и проведения сравнения между различными вариантами обработки или клеточными линиями.
- Трансляционные исследования: Связь данных механистического имиджинга с моделями релевантных заболеваний и стратегиями поиска биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: Предоставление универсальной платформы для изучения различных белков и путей DDR в рамках множества проектов.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: повышает достоверность прогнозов и снижает механистическую неопределенность при валидации мишеней DDR.
- Операционная ценность: стандартизирует рабочие процессы визуализации живых клеток для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости.
- Стратегическая ценность: обосновывает принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и распределение капитала за счет предоставления надежных механистических данных.
- Влияние на портфель: поддерживает приоритизацию активов, нацеленных на DDR, с учетом рисков, а также стратегии разработки трансляционных биомаркеров.
Особенности внедрения
- Требуется опыт в области прижизненной визуализации клеток, инженерии флуоресцентных белков и анализа изображений.
- Необходим доступ к современному конфокальному микроскопу и системам контроля условий окружающей среды.
- Требуется межкомандная стандартизация протоколов визуализации и конвейеров анализа данных.
- Метод может быть адаптирован для различных клеточных линий и белков DDR при соответствующем дизайне конструкций.
- Условия визуализации должны быть оптимизированы для минимизации фотовыцветания и обеспечения качества данных.
