Напряжение чувствительные краски Запись с аксонов, дендритов и дендритных шипиков отдельных нейронов в срезах мозга
29 ноября 2012 г.
Методом визуализации для мониторинга изменений мембранного потенциала с суб-микронных пространственных и суб-миллисекунды временное разрешение описано. Методика, основанная на лазерном возбуждении напряжение чувствительных красителей, позволяет измерять сигналы в аксонов и аксонов залогов, терминал дендритных ветвей и отдельных дендритных шипиков.
Общая цель описанных экспериментов заключается в оптическом мониторинге интеграции сигналов мембранного потенциала и обработки информации отдельной нервной клеткой с субмикронным и субмиллисекундным разрешением в нескольких точках нейрона. Это достигается путем первоначального создания системы визуализации с соответствующей чувствительностью, позволяющей регистрировать небольшие относительные изменения интенсивности света, соответствующие переходным процессам мембранного потенциала. Затем следует выбрать нейроны с подходящей анатомией для эффективной визуализации — нейроны с длинными неповрежденными отростками, расположенными в одной фокальной плоскости близко к поверхности среза.
Затем в предварительно выбранные нейроны вводят вольтаж-чувствительные красители для обеспечения возможности оптического отслеживания изменений мембранного потенциала. Результаты демонстрируют уникальную способность данного подхода получать информацию об интеграции электрических сигналов отдельными нервными клетками путем мониторинга сигналов мембранного потенциала аксонов, дендритов и дендритных шипиков в клеточной нейрофизиологии.
Новые инструменты разрабатываются в связи с двумя давними ограничениями традиционной электрофизиологии: низким пространственным разрешением электродных измерений и невозможностью регистрации сигналов из малых структур, таких как коллатерали аксонов или дендритные шипики. Чтобы преодолеть эти недостатки, метод патч-клампа можно сочетать с оптическими методами, которые позволяют осуществлять параллельную запись из всех частей нейрона. Здесь мы описываем такой метод — многоточечную боковую оптическую регистрацию переходных процессов мембранного потенциала с разрешением до отдельного шипика.
В данном эксперименте для настройки равномерного освещения используются вертикальный микроскоп и три камеры. Сначала установите подходящий фильтр нейтральной плотности на пути лазерного луча. Затем сфокусируйте объектив на поверхности стандартного флуоресцентного предметного стекла.
Наблюдая за ПЗС-изображением поля зрения на экране монитора, отрегулируйте положение приемного конца кварцевого световода и положение выходного конца световода с помощью соответствующих приводов на эпифлуоресцентном конденсоре, чтобы добиться центрированного и равномерного освещения поля зрения. Для определения вибрационного шума используйте стандартный флуоресцентный предметный слайд с нефлуоресцирующей меткой на поверхности. Запишите интенсивность света с помощью нейро-ПЗС в режиме непрерывной съемки.
Наведите объектив на темный край черной метки и запишите интенсивность света в течение примерно 100 миллисекунд с частотой кадров 2 кГц. Затем отобразите пространственное среднее следов относительной интенсивности света от примерно 20 пикселей, получающих свет из равномерно освещенной области, и от примерно 20 пикселей вдоль края черной метки. Избыточный шум в пространственном среднем пикселей с высококонтрастными краями отражает вибрационный шум в системе.
Необходимо установить механический затвор вне виброизоляционного стола, чтобы открытие затвора не вносило вибрационный шум в оптическую запись. Это критически важный этап. Закрепите затвор с помощью пластиковых винтов и виброизоляционного материала, чтобы снизить акустический вибрационный шум, который может быть зафиксирован системой оптической записи.
Для изоляции вибрации отрегулируйте виброизоляционный стол до тех пор, пока вибрационный шум пикселей, охватывающих резкий край изображения, не станет меньше дробового шума. Провода оборудования на столе должны быть закреплены свободно, чтобы избежать передачи механических вибраций на корпус микроскопа. В данной процедуре подготовьте срезы мозга толщиной от 300 до 400 микрон в соответствии со стандартными протоколами, используя линию мышей, экспрессирующих EGFP в интересующих отдельных нервных клетках, с применением конфокальной системы со сканирующим диском.
Визуализируйте нейроны, меченные EGFP, в срезе. Затем для визуализации мембранного потенциала выберите нейроны с сохранными дендритно-аксональными деревьями, отростки которых проходят параллельно и близко к поверхности среза. После этого заполните стеклянную патч-пипетку от кончика внутриклеточным раствором без красителя примерно до двух третей конуса электрода, прикладывая отрицательное давление в течение около 15 секунд.
После этого заполните электрод раствором, содержащим мембранный IMP пермеатный вольт-чувствительный краситель, растворенный во внутриклеточном растворе. Затем, в течение одной минуты после заполнения электрода красителем, проведите патч-кламп предварительно выбранного нейрона. Перед погружением пипетки в ванночку приложите низкое положительное давление примерно 10 мм рт ст; это обеспечит отсутствие утечки красителя из электрода при позиционировании в срезе до момента формирования герметичного соединения.
Непосредственно перед касанием поверхности клетки электродом увеличьте давление до высокого уровня, примерно 100 мм рт. ст. После установления герметичного контакта в конфигурации «whole cell» (целая клетка) обеспечьте свободную диффузию красителя из соматической патч-пипетки в сому в течение 20–45 минут. Во время диффузии красителя контролируйте физиологическое состояние нейрона, регистрируя вызванные потенциалы действия в режиме фиксации тока (current clamp).
Кроме того, контролируйте степень окрашивания, записывая интенсивность покоящегося света от сомы клетки с частотой кадров 2 кГц и при частичной интенсивности света, отрегулированной с помощью нейтральных светофильтров. Продолжайте процесс загрузки до тех пор, пока потенциал действия не начнет расширяться. По окончании окрашивания осторожно отведите патч-пипетку от сомы в конфигурации фиксации напряжения, чтобы обеспечить переход из конфигурации всей клетки в конфигурацию патча «снаружи-наружу» (outside-out) в ходе данного процесса.
Затем инкубируйте срез еще от 1,5 до двух часов при комнатной температуре, чтобы дать вольт-чувствительному красителю проникнуть в нейрональные отростки. После того как значительное количество красителя диффундирует из сомы в дендритные и аксональные отростки, форма волны потенциала действия должна полностью восстановиться. На следующем этапе найдите сому окрашенного нейрона при слабом флуоресцентном освещении.
С помощью нейтральных светофильтров снизьте интенсивность освещения до минимального уровня, необходимого для визуализации исследуемого объекта с использованием XY-столика. Сканируйте область среза, содержащую флуоресцентный нейрон, до тех пор, пока не будет обнаружено флуоресцирующее тело клетки. Расположите сому окрашенной клетки в центре поля зрения микроскопа и проведите патч-зажим нейрона с помощью стандартного патч-электрода без красителя в режиме DIC. Затем визуализируйте нейронные отростки при низкой интенсивности флуоресценции с частотой кадров от 10 до 40 hertz в режиме непрерывной записи ПЗС-матрицы для вольтажного имиджинга.
Используя XY-столик, переместите интересующий нейрональный отросток в центр области визуализации. Кроме того, чтобы уменьшить фотодинамическое повреждение, защитите тело нейрона (SOMA) от возбуждающего света, используя частично закрытую диафрагму ограничителя поля микроскопа. Затем зарегистрируйте оптические сигналы, связанные с обратно распространяющимися потенциалами действия в отдельных дендритных ветвях.
Затем зарегистрируйте оптические сигналы, связанные с потенциалами действия в аксоне. После этого зарегистрируйте оптические сигналы, связанные с ретроградно распространяющимися потенциалами действия в дендритных шипиках. Используйте соответствующую частоту кадров для точной реконструкции формы сигнала.
В то же время старайтесь максимально сократить периоды записи и время воздействия высокоинтенсивного возбуждающего света, чтобы минимизировать выгорание красителя и фотодинамические повреждения. Здесь показана запись оптических сигналов. На верхней панели представлено конфокальное изображение окрашенного нейрона с его аксоном в положении записи с высоким разрешением.
В то время как на средней панели представлено флуоресцентное изображение аксона с низким пространственным разрешением, полученное с помощью ПЗС-матрицы, используемой для визуализации мембранного потенциала, на нижней панели показаны электродные записи от сомы и оптические записи от начального сегмента аксона (AIS) и узла Ранвье. Представлены необработанные данные и обработанные сигналы. На данном рисунке показаны сигналы потенциала действия из аксона кортикального нейрона слоя L5, нагруженного вольт-чувствительным красителем.
Потенциальные соответствующие сигналы регистрировали с частотой кадров 10 килогерц. Эти записи отображают переходный процесс потенциала действия в трех точках. Первая — электрод, регистрирующий сигнал от сомы.
Во-вторых, оптические записи из конуса аксона, и в-третьих, оптическая запись из первого узла Ранвье; здесь представлены наложенные друг на друга сигналы из этих же трех локаций. На данном рисунке показан всплеск из четырех обратно распространяющихся потенциалов действия из нескольких точек дендритного дерева кортикального нейрона слоя L5, инициированных короткими деполяризующими импульсами тока с частотой 100 Hz. Здесь представлены сигналы потенциала действия из отдельного дендритного шипика.
Здесь представлена анатомическая реконструкция, полученная из стека изображений, снятых на конфокальном микроскопе с вращающимся диском, а здесь — флуоресцентное изображение той же области, полученное с помощью ПЗС-камеры. Для визуализации мембранного потенциала на правой панели показаны кривые интенсивности флуоресценции, соответствующие обратно распространяющимся потенциалам действия из точек с первой по третью, отмеченных на ПЗС-изображении. Нижняя кривая соответствует записи электрода из сомы.
Подготовка к записи занимает около трех часов, включая время ожидания распространения красителя к дистальным отросткам. Время записи ограничено естественным ухудшением состояния препарата и фотодинамическим повреждением, вызванным PO. Степень фотодинамического повреждения пропорциональна интенсивности возбуждающего света, а также продолжительности и количеству отдельных попыток записи.
В некоторых экспериментах можно провести более 50 регистрирующих проб в течение одного или двух часов. Другие измерения требуют высокого возбуждения, интенсивности света и более длительной записи, и в силу фотодинамического повреждения ограничены лишь несколькими попытками записи. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить визуализацию напряжения во всей аксональной и дендритной структуре отдельных нейронов в срезах мозга.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается метод визуализации для мониторинга изменений мембранного потенциала в нейронах с субмикронным пространственным и субмиллисекундным временным разрешением. Метод основан на лазерном возбуждении вольтаж-чувствительных красителей для регистрации сигналов от различных нейрональных структур.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная нейрофизиология
- Методы нейровизуализации
- Мониторинг мембранного потенциала
Теоретические основы
- Понимание мембранного потенциала имеет решающее значение для изучения функций нейронов.
- Традиционным методам может не хватать пространственного и временного разрешения, необходимых для детального анализа.
- Вольт-чувствительные красители позволяют оптически отслеживать изменения мембранного потенциала.
- Системы визуализации должны обладать достаточной чувствительностью для регистрации небольших изменений интенсивности света.
Цель исследования
- Для мониторинга интеграции сигналов мембранного потенциала в отдельных нервных клетках.
- Для получения изображений высокого разрешения из нескольких точек одного нейрона.
- Для изучения интеграции электрических сигналов в аксонах, дендритах и дендритных шипиках.
Используемые методы
- Создание установки для визуализации с высокой чувствительностью.
- Отбор нейронов с подходящей анатомией для эффективной визуализации.
- Загрузка нейронов вольтаж-чувствительными красителями.
- Оптическое отслеживание изменений мембранного потенциала в различных структурах нейронов.
Основные результаты
- Данный метод позволяет детально отслеживать изменения мембранного потенциала.
- Результаты демонстрируют возможность наблюдения за интеграцией сигналов в отдельных нервных клетках.
- Информация получается из аксонов, дендритов и дендритных шипиков.
- Этот подход расширяет понимание механизмов обработки информации нейронами.
Выводы
- Описанный метод визуализации дает ценные сведения о функционировании нейронов.
- Он позволяет изучать интеграцию электрических сигналов с высоким разрешением.
- Данный метод может способствовать развитию исследований в области клеточной нейрофизиологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Визуализация с использованием вольт-чувствительных красителей позволяет контролировать динамику мембранного потенциала в различных отделах нейронов с субмикрометровым и субмиллисекундным разрешением, что восполняет критический пробел в электрофизиологии при изучении интеграции сигналов в аксонах, дендритах и шипиках. Эта возможность способствует снижению механистических рисков при валидации мишеней, обеспечивая прямые количественные показатели электрического поведения нейронов в системах, релевантных для конкретных заболеваний. Данный метод повышает прогностическую достоверность доклинических моделей за счет параллельной высокоточной регистрации сигналов из нескольких участков отдельных нейронов, что дает важную информацию для идентификации ведущих соединений и разработки стратегий модуляции сигнальных путей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем количественного анализа подпороговых и надпороговых событий мембранного потенциала в аксонах, дендритах и дендритных шипиках.
- Операционная ценность: обеспечивает линейный, не зависящий от красителя флуоресцентный отклик мембранного потенциала в физиологическом диапазоне (от -100 mV до +100 mV), что позволяет последовательно оценивать взаимодействие с мишенью.
- Прогностическая ценность: способствует снижению биологических рисков за счет обратимого нефармакологического введения красителя (JPW 3028), не оказывающего обнаруживаемого влияния на функцию нейронов.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает генерацию количественных оптических сигналов из сотен точек регистрации на один нейрон, что позволяет проводить высококонтентный анализ распространения и интеграции сигналов.
- Воспроизводимость: поддерживает стабильную запись в течение длительных периодов (до сотен проб) до появления фототоксических эффектов, что гарантирует согласованность анализа.
- Масштабируемость: совместимость с лазерным возбуждением и многокамерной детекцией для параллельного мониторинга аксональных, дендритных компартментов и шипиков.
Трансляционные и доклинические исследования
- Система, релевантная для заболеваний: Применима к срезам мозга с генетически маркированными нейронами (например, линиями, экспрессирующими EGFP), что позволяет изучать нейронные цепи в моделях неврологических расстройств.
- Трансляционная преемственность: Связывает этап открытий с доклинической валидацией путем регистрации динамики сигналов в режиме реального времени в дендритных шипиках и аксонах — ключевых участках синаптической пластичности и сетевой дисфункции.
- Прогресс с учетом рисков: Обосновывает решения о продолжении или прекращении исследований (go/no-go) путем количественной оценки того, как возмущения влияют на интеграцию сигналов в различных компартментах нейронов.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод интегрируется в континуум исследований — от ранней валидации мишени до доклинического скрининга, где визуализация мембранного потенциала с высоким разрешением обеспечивает проверку гипотез и оценку соединений-лидеров в нейронных системах.
- Биология открытий: способствует уточнению путей передачи сигналов посредством мониторинга ретроградных потенциалов действия в дендритах и аксонах, раскрывая механизмы суммирования и затухания сигналов.
- Скрининг: обеспечивает стандартизацию анализа за счет равномерной калибровки освещения и минимизации вибрационного шума, что критически важно для надежной оптической регистрации.
- Аналитика: предоставляет количественные трейсы интенсивности флуоресценции, соответствующие переходным процессам мембранного потенциала, что позволяет напрямую сравнивать формы сигналов при различных условиях.
- Трансляционные исследования: связывает результаты с доклинической работой путем фиксации паттернов сигналинга на уровне шипиков и аксонов, имеющих значение для механизмов нейропсихиатрических и нейродегенеративных заболеваний.
- Корпоративное повторное использование: создает многократно используемую платформу визуализации для лонгитюдных исследований функций нейронов в рамках различных экспериментальных парадигм.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет регистрации электрических сигналов от субклеточных структур (например, дендритных шипиков), недоступных для обычных электродов.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию с помощью фильтров нейтральной плотности, виброизоляции и протоколов контролируемой диффузии красителей для минимизации фотодинамических повреждений и выгорания.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала за счет снижения зависимости от низкопроизводительных методов электрофизиологии для получения данных с субклеточным разрешением.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритезацию мишеней с учетом рисков на основе количественных эффектов на интеграцию нейронных сигналов в валидированных системах, релевантных конкретным заболеваниям.
Особенности реализации
- Требуются экспертные знания в области оптической визуализации, патч-электрофизиологии и работы с вольтаж-чувствительными красителями.
- Метод зависит от наличия лазерных источников света, высокоскоростных CCD-камер и виброизоляционных столов для обеспечения субмиллисекундной чувствительности.
- Необходима межгрупповая стандартизация продолжительности окрашивания, интенсивности возбуждения и частоты кадров для обеспечения воспроизводимости результатов в разных лабораториях.
- Требуется адаптация протокола для различных типов нейронов и областей мозга с учетом анатомической целостности и ориентации отростков относительно поверхности среза.
- Метод ограничен риском фотодинамического повреждения при высокой интенсивности возбуждения и длительной записи, что ограничивает количество попыток в зависимости от экспозиции и продолжительности воздействия света.
