Визуальное описание вскрытия головного сосудистой поверхности и связанного с мозговых оболочек и сосудистых сплетений из мозга крысы

Общая цель данной процедуры заключается в эффективном и оперативном препарировании твердой и паутинной оболочек мозговых оболочек и связанных с ними артериальных сосудов, покрывающих поверхность коры переднего мозга, среднего мозга, таламуса и мозолистых тел, а также в извлечении сосудистого сплетения из боковых желудочков. Это достигается путем первоначального удаления шишковидной железы и отделения мозговых оболочек и артериальных деревьев, прилегающих к переднему мозгу. Затем артерии и артериолы на поверхности коры осторожно удаляются, начиная с вентрального круга Виллиса и продвигаясь к дорсальным поверхностям коры, таким образом, чтобы твердая и оставшиеся паутинные оболочки оставались прикрепленными к сосудам, при этом стараясь свести к минимуму захват прилегающих тканей поверхности коры.

Затем кора и комиссуральные волокна отделяются от перегородки и гиппокампа, открывая доступ к боковым желудочкам для забора сосудистого сплетения. В завершение удаляют гиппокамп, обнажая таламус и валики среднего мозга. После этого отделяют мозговые оболочки и связанные с ними сосуды, покрывающие эту область.

В конечном счете, целостность и специфичность выделенных мозговых оболочек и связанного с ними артериального русла, а также сосудистого сплетения, могут быть определены путем сравнения профилей экспрессии генов в каждой из этих областей. Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы исследований, касающихся сосудистой системы, поддерживающей функции мозга. Он включает поиск сходств, проведение сопоставительного анализа и выявление различий в функциях сосудистого сплетения по сравнению с мозговыми оболочками и связанным с ними артериальным руслом в отношении кровотока, функций ЦСЖ, воздействия нейротоксинов и травм головного мозга.

Для начала данного протокола поместите голы brains, извлеченные из крыс сразу после эвтаназии, в ледяной физиологический раствор на пять минут. Важно дать мозгу охладиться в течение этого времени перед диссекцией, чтобы мозговые оболочки и связанная с ними артериальная сосудистая сеть (MAV) могли быть отделены от поверхности коры. Затем поместите мозг на дно стеклянной чашки Петри, стоящей на льду, с добавлением одного сантиметра ледяного физиологического раствора или 0,1 M натрий-фосфатного буферного раствора с pH 7,4.

Все этапы диссекции следует проводить, погрузив мозг в физиологический раствор. Для начала диссекции поместите мозг в чашку Петри дорсальной стороной вверх и найдите эпифиз (шишковидную железу), расположенный в самой медиальной вентральной области между двумя полушариями, рострально по отношению к мозжечку, непосредственно под мозговыми оболочками или на их поверхности.

Над colli. Удалите эпифиз с помощью двух маленьких пинцетов с изогнутыми кончиками. Обратите внимание, что эпифиз имеет розовый цвет, как и кора, но часто окружен остатками крови и сосудов, оставшимися после удаления головного мозга.

Затем переверните мозг в чашке Петри. После этого отделите позвоночную артерию, более мелкие артерии и мозговые оболочки, покрывающие мост, от мозговых оболочек и сосудов переднего мозга. Далее приступите к удалению MAV.

Важно начать процесс диссекции с вентральной стороны, с основных артерий круга Виллизиуса, средних мозговых и передних мозговых артерий. Затем, начиная с любого полушария, с помощью небольшого изогнутого пинцета пересеките заднюю соединительную артерию сразу за местом ее соединения с внутренней сонной артерией, отделяя таким образом передние и задние артериальные сети переднего мозга. Затем повторите ту же процедуру для противоположного полушария.

Теперь, захватив среднюю мозговую артерию (MCA) и переднюю артерию пинцетом, осторожно потяните их в переднедорсальном направлении, чтобы артериовенозная мальформация (AVM), покрывающая вентральную часть передней коры, переместилась над обонятельным трактом. Это позволит удалить большую часть AVM, покрывающей переднюю кору. Поверните мозг под углом от 45 до 90 градусов относительно чашки Петри, чтобы освободить от коры латеральные передние области AVM, окружающие латеральные области коры; захватите MCA и связанные с ней артерии и осторожно потяните их дорсально вдоль коры.

При необходимости концами пинцета можно приподнимать и отделять крупные артерии от коры во время диссекции. Теперь удалите более задние латеральные области AVM. Обратите внимание, что в процессе забора материала лучше переходить от одного полушария к другому, чтобы AVM оставалась охлажденной и гидратированной; также переходите на другое полушарие, если при отделении AVM от коры возникает какое-либо сопротивление.

Наконец, чтобы удалить наиболее дорсальные области MAV, окружающие первичную соматосенсорную и моторную кору, переверните мозг дорсальной стороной вверх, чтобы освободить этот участок, и используйте кончики пинцета вдоль сагиттального синуса. Эту часть извлеченной MAV можно временно хранить в ледяном физиологическом растворе до начала тестирования и анализа или заморозить для последующей обработки. Часто MAV, покрывающая наиболее задние отделы коры, остается прикрепленной.

Процедура ее удаления показана в следующем разделе этого видео. Чтобы удалить сосудистое сплетение, сначала расположите мозг дорсальной стороной вверх и зафиксируйте его большими пинцетом. Затем введите малый пинцет по срединной линии между полушариями и с помощью его концов проколите кору и мозолистое тело, продвигаясь в верхнюю часть срединной линии гиппокампа.

Затем с помощью пинцета отодвиньте кору вместе с мозолистым телом от дорсального гиппокампа и перегородки, чтобы обнажить большую часть бокового желудочка. Хориоидное сплетение можно найти и идентифицировать по волнообразной красной линии, которая отмечает основную артерию, проходящую вдоль него. Используя два конца пинцета, раздвиньте боковые стенки третьего желудочка и расширьте его в самой узкой части.

Затем с помощью маленького пинцета аккуратно извлеките этот конец хориоидного сплетения. Далее с помощью пинцета расширьте крайнюю переднюю область между перегородкой и областью хвостатого ядра и скорлупы, чтобы освободить хориоидное сплетение и с этого конца. Выполните ту же процедуру на противоположном полушарии, чтобы извлечь второе оставшееся хориоидное сплетение.

Повторим, что эту ткань можно временно хранить на льду, в охлажденном физрастворе или заморозить для последующей обработки. Чтобы удалить оставшуюся часть MAV, покрывающую наиболее задние области коры, сначала удалите весь гиппокамп из обоих полушарий, обнажив MAV над таламусом и холмиками. Обратите внимание, что удаление этой части MAV будет значительно проще, чем удаление оставшейся части MAV из коры.

Захватывая крупные сосуды, расположенные над передней частью таламуса, и осторожно потянув их, следует учитывать, что эти сосуды соединены с супрахориальной сетью и обеспечивают кровоснабжение дорсального гиппокампа и сети дорсального таламуса. Аккуратно оттяните сосуды, пока супрахориальная сеть не освободится, что позволит добраться до последних участков артериального круга. На этом этапе необходимо соблюдать особую осторожность при удалении любой оставшейся АВМ с поверхности гранулярной ретролинейной первичной слуховой и зрительной коры.

Все оставшиеся части задней вентральной кортикальной области MAV, извлеченные при этом втором сечении таламуса и мозолистого тела MAV, следует удалить и добавить к первой диссецированной кортикальной секции MAV, если планируется их раздельный анализ. Далее, для сравнения профилей экспрессии генов в стриатуме, теменной коре и областях MAV в контрольных условиях можно провести анализ экспрессии генов с использованием олигонуклеотидных микрочипов Agilent 0 1 4 8 7 9 (полный геном крысы, формат 4x44, 060-меры). Более подробную информацию о подготовке, сканировании и первичном хранении данных можно найти в работе Thomas et al.

При правильном выполнении диссекции полученные ткани MAV должны представлять собой две целостные части общим весом примерно 35–45 мг. Первоначально выделенная часть MAV, окружающая большую часть коры, должна весить около 25 мг, а часть, покрывающая таламус, мозолистое тело и затылочную кору, — около 15 мг.

Ткань должна иметь слегка розоватый цвет из-за остатков крови в сосудах. Извлеченные двусторонние сплетения сосудистого сплетения должны представлять собой два целых образца ткани, каждый из которых весит от одного до двух миллиграммов, как показано здесь. Здесь представлено сравнение профилей экспрессии генов в стриатуме, теменной коре и MAV в контрольных условиях.

На верхнем графике показан уровень экспрессии в стриатуме по сравнению с теменной корой. В то время как на нижнем графике показана экспрессия в MAV по сравнению с теменной корой, видно, что стриатум и теменная кора гораздо более тесно связаны друг с другом, чем MAV. Здесь мы видим дифференциальную экспрессию генов в MAV в ответ на гипертермию по сравнению с контролем, в ответ на амфетамин по сравнению с контролем, а также при гипертермии в сравнении с амфетамином.

Наконец, здесь представлены гены, экспрессия которых в MAV более чем в 15 раз выше, чем в теменной коре и стриатуме, сгруппированные по функциям. Многие из этих генов связаны с сосудистой и/или иммунной системой. Другие гены с очень значительными изменениями кратности экспрессии кодируют белки внеклеточного матрикса, транспортеры саутате, а также участвуют в метаболизме липидов и ретиноевой кислоты.

При выполнении данной процедуры важно проявлять терпение во время диссекции MAV. Также необходимо, чтобы мозг оставался погруженным в изотонический раствор физиологического или фосфатно-солевого буфера на протяжении всего процесса диссекции. Кроме того, рекомендуется потренироваться в выделении MAV на четырех или пяти крысах перед началом получения тканей для сбора экспериментальных данных.