Одновременное внутриклеточной регистрации мотонейронов поясничного и силы, возникающей в ее мотор в взрослой мыши

Общая цель данной процедуры заключается в изучении электрофизиологических и сократительных свойств отдельного моторного звена мыши путем проведения внутриклеточной регистрации моторных нейронов in vivo. Для этого сначала обнажают спинной мозг и исследуемую мышцу, после чего к сухожилию мышцы прикрепляют датчик силы.

Затем моторный нейрон стимулируют с помощью внутриклеточного электрода, что вызывает сокращение регистрируемого двигательного звена. В конечном итоге можно одновременно охарактеризовать электрофизиологические свойства моторного нейрона и сократительные свойства соответствующего двигательного звена. Визуальная демонстрация этой методики имеет решающее значение, так как этапы микрохирургического вмешательства очень трудно освоить из-за малых размеров животного.

Для начала процедуры анестезируйте мышь, вводя пентобарбитал натрия или смесь кетамина и ксилазина внутрибрюшинно. Убедитесь в отсутствии рефлекса отщипывания пальца у мыши. Затем сделайте разрез над трахеей с помощью тупоконечных ножниц и разведите кожу в стороны.

Затем раздвиньте слюнную железу с помощью тупых пинцетов. Чтобы обнажить две тонкие мышцы, покрывающие трахею, разведите их в стороны. Используйте пинцет Dumont №7.

Пропустите две нити аутологического шелкового шовного материала калибром 4-0 под трахеей. Затем сделайте поперечный разрез трахеи между двумя хрящевыми кольцами. Будьте осторожны, чтобы не пересечь трахею полностью.

Теперь введите трахеальную трубку в трахею. Зафиксируйте обе стороны отверстия введения, завязав над ним швы. После этого подключите трахеальную трубку к вентилятору для мышей и капнографу.

Затем подключите аппарат ИВЛ к источнику чистого кислорода через комплаенс-пакет. Настройте параметры вентилятора таким образом, чтобы мышь не сопротивлялась искусственной вентиляции, а парциальное давление углекислого газа в конце выдоха оставалось стабильным в пределах от 4 до 5%. На данном этапе обнажите яремную вену с одной стороны шеи, используя методы тупой диссекции.

Яремная вена разделяется на два основных ствола — переднюю и заднюю лицевые вены. Осторожно отделите вену от окружающей соединительной ткани. Затем просуньте две нити шелкового шовного материала 6-0 под вену, расположив их максимально далеко друг от друга по всей длине вены.

Затем установите небольшой сосудистый зажим на проксимальном конце вены и перевяжите дистальный конец вены. С помощью очень тонких ирисных ножниц сделайте небольшой поперечный разрез в вене. Будьте очень осторожны, чтобы не пересечь вену полностью.

После этого введите предварительно заполненный катетер размера 1 French в отверстие до сосудистого зажима, который удерживает вену и катетер вместе. Осторожно снимите сосудистый зажим. Затем продвиньте катетер в вену еще на несколько миллиметров. Закрепите катетер, завязав швы по обе стороны от места введения.

Затем подсоедините один из катетеров к шприцу или шприцевому насосу для введения дополнительных доз анестетиков, таких как пентобарбитал натрия или кетамин-ксилазин. Повторите процедуру для другой вены и подсоедините второй катетер к шприцевому насосу для медленной внутривенной инфузии 4% раствора глюкозы, содержащего 1% бикарбоната натрия и 14% плазмона. В завершение зашейте кожу в области шеи с помощью иглы и шовного материала.

После этого верните мышь в положение на животе. Теперь сделайте разрез от верхней части бедра до ахиллова сухожилия. Отделите кожу от подлежащих мышц, стараясь не повредить кровеносные сосуды.

Затем определите передний край двуглавой мышцы бедра, который выглядит как белая линия, проходящая вдоль бедра. После этого осторожно сделайте разрез вдоль этой линии от колена до тазовой кости. Раздвиньте мышцы, чтобы обнажить седалищный нерв, расположенный под двуглавой мышцей бедра.

Осторожно препарируйте двуглавую мышцу бедра и удалите ее. Чтобы обнажить седалищный нерв и мышцы трехглавой мышцы голени, идентифицируйте большеберцовый нерв между общим малоберцовым и икроножным нервами. Среди различных ветвей большеберцового нерва отличите ветви, иннервирующие трехглавую мышцу голени, от ветвей, уходящих глубже.

Используя шелковую нить OTT размера восемь, перевяжите все ветви большеберцового нерва, оставив нетронутыми ветви, иннервирующие m. triceps surae. Перережьте большеберцовый нерв как можно дальше от узла. Определите позвонки T 13 и L 1, при этом T 13 является последним позвонком, к которому прикрепляются ребра.

Затем иммобилизируйте позвоночный столб с помощью зажимов Каннингема, зафиксировав их с каждой стороны в области T 13 и L 1. Будьте осторожны, чтобы не сдавить спинной мозг, но приложите небольшое натяжение вдоль продольной оси. Убедитесь, что позвоночный столб надежно закреплен, осторожно прижимая его пинцетом.

С помощью тонких хирургических ножорков удалите остистые отростки, а затем дугоотростки в области T 13 и L 1, чтобы обнажить спинной мозг. Затем установите изготовленную на заказ пластиковую ванночку вокруг спинного мозга. После этого зафиксируйте ванночку на месте с помощью шелковой нити размера 4-0.

Наконец, убедитесь в водонепроницаемости ванны, загерметизировав ее быстрозастывающим герметиком. После высыхания герметика снимите вату, покрывающую спинной мозг, и заполните ванну минеральным маслом. Используйте еще один позвоночный зажим, чтобы зафиксировать остистый отросток в области крестца.

Для поддержки спинной области животного используйте третий зажим, чтобы иммобилизовать правую заднюю конечность и голеностопный сустав, согнув ногу под углом 90 градусов в коленном и голеностопном суставах. Удалите марлю, покрывающую область задней конечности. Препарируйте ахиллово сухожилие, отделив его от окружающих тканей.

Максимально аккуратно отделите трицепс от окружающих тканей с помощью иглы с нитью. Проведите шелковую нить размера 6-0 через ахиллово сухожилие и завяжите тройной узел вокруг него. Затем расположите датчик силы рядом с узлом.

После этого закрепите сухожилие на датчике силы с помощью шелковой нити и отсеките дистальную часть сухожилия. Затем введите две проволоки из нержавеющей стали под фасцию мышц m. triceps surae. Эти проволоки подключаются к внеклеточному AC-усилителю.

Для регистрации ЭМГ поместите нерв m. triceps surae на катод крючкообразного электрода, при этом анод должен касаться прилегающей мышцы. Затем стимулируйте нерв m. triceps surae прямоугольными импульсами длительностью 50 microsecond с постепенно увеличивающейся интенсивностью при низкой частоте до достижения максимальной амплитуды сокращения. Затем стимулируйте нерв m. triceps surae прямоугольными импульсами длительностью 50 microsecond с постепенно увеличивающейся интенсивностью при низкой частоте до достижения максимальной амплитуды сокращения.

На этих рисунках показано, как идентифицировать мотонейрон из группы мышц трехглавой мышцы плеча. После проникновения при низкой интенсивности стимуляции наблюдается только моносинаптический ВПСП, а при более высокой интенсивности — только моносинаптический ВПСП. При еще более высокой интенсивности стимуляции амплитуда ВПСП может стать достаточно большой, чтобы вызвать ортодромальный спайк по принципу «все или ничего».

Антидромный спайк возникает с меньшей латентностью, чем моносинаптический ВПСП. Если через микроэлектрод подать ток достаточной силы для инициации спайка, то через короткий промежуток времени в мышце можно будет зарегистрировать ЭМГ-активность, за которой последует мышечное сокращение.

После идентификации мотонейрона можно охарактеризовать его электрофизиологические свойства. Например, на этом рисунке показано, как измерить входное сопротивление с помощью гиперполяризующих и деполяризующих импульсов тока, построив график зависимости изменений мембранного потенциала от величины инжектированного тока. Сократительные свойства двигательной единицы также могут быть изучены с использованием различных протоколов стимуляции.

Например, зависимость силы от частоты можно получить путем подачи коротких импульсов тока с различной частотой в мотонейрон. Затем значение стационарной силы можно отнести к частоте импульсов тока для построения сигмоидной кривой зависимости силы от частоты. После освоения хирургической техники часть данной процедуры при правильном выполнении может занять три часа.