Ассоциативный аппетит обонятельного обучения в

Целью данной процедуры является анализ высших функций головного мозга. В простой модели на личинках DFA это реализуется посредством изучения аппетита и ассоциативного обонятельного обучения. Для этого сначала из флакона с кормом собирают 30 сытых личинок третьей стадии развития.

Затем личинок обучают в течение пяти минут в чашке Петри, используя фруктозу в качестве поощрения и контейнеры с запахом по обе стороны, один из которых содержит октанол в качестве ольфакторного стимула. После этого проводится второй этап обучения продолжительностью пять минут в чашке без фруктозы, с контейнерами с запахом по обе стороны, содержащими амилацетат. После трех повторений этих двух этапов обучения личинок подвергают пятиминутному тесту без поощрения, помещая их между контейнерами с запахом на противоположных сторонах.

В конечном счете, относительное предпочтение одного запаха по сравнению с ацетатом амала указывает на то, что личинки дрозофил способны формировать ассоциацию между обонятельными стимулами и сахарным вознаграждением, и это может быть использовано для изучения ассоциативного обучения в генетически пластичной системе. Данный метод в сочетании с генетическим вмешательством в функции нейронов может помочь ответить на ключевые вопросы в области обучения и памяти, такие как: какие нейроны сигнализируют о вознаграждении или какие нейроны необходимы или достаточны для формирования или извлечения повторяющейся памяти? Демонстрация процедуры будет представлена в послеоперационном периоде.

Аспирант моей лаборатории сначала готовит чашки Петри с 2,5% AGAR без фруктозы. Для приготовления чашек с фруктозой добавьте фруктозу в растворенный AGAR, а затем разлейте смесь по чашкам. Затем пометьте каждую из этих чашек различным символом, чтобы обеспечить слепой метод проведения эксперимента.

Чашка, содержащая фруктозу, служит подкрепляющей наградой, а пустая чашка — отсутствием награды. В качестве условных стимулов подготовьте три индивидуальных тефлоновых контейнера для запахов, в каждый из которых внесите 10 µL чистого октанола. В крышках контейнеров имеются небольшие отверстия для испарения вещества.

Во-вторых, подготовьте еще три контейнера с запахом, содержащих 10 µL амилацетата, разведенного в парафиновом масле в соотношении 1:50. Данный разведение так же привлекательно, как 10 µL чистого октанола; начните со сбора 30 особей, которые питаются, а не блуждают. В-третьих, из флакона с пищей.

Данный протокол можно выполнять в любое время суток, так как он не зависит от циркадных ритмов. Перенесите личинок в чашку Петри с несколькими каплями водопроводной воды и осторожно перемещайте их вперед и назад с помощью кисточки.

Затем перенесите личинок во вторую чашку Петри, в которой также находится несколько капель водопроводной воды. Осмотрите личинок на наличие пищевой пасты на стенках их тела. Теперь поместите чашку Петри в экспериментальную установку, чтобы приучить личинок ассоциировать запахи с определенным сахарным сигналом.

Поместите контейнеры с запахами по левую и правую стороны одной из двух типов чашек, используемых для стимулов. Здесь приведена одна из них, однако выбор произволен, так как экспериментатор не знает, где находится награда. Затем поместите группу личинок в центр чашки.

Закройте крышку и подождите пять минут, пока животные подвергаются воздействию стимулов. Убедитесь, что личинки способны преодолеть поверхностное натяжение капли воды, чтобы они не оказались в ловушке и могли свободно исследовать пространство. Поместите новый контейнер с ацетатом амала на чистую чашку Петри.

Через пять минут с помощью увлажненной кисточки перенесите личинок в чашку с противоположным типом стимулов, расположенных слева и справа. В данном случае запахом является амилацетат. После переноса личинок закройте крышку и дайте животным исследовать среду в течение пяти минут.

По истечении этого времени первый раунд обучения считается завершенным. Проведите еще два раунда обучения таким же образом, как и первый. Переносите животных с помощью влажной кисточки, подвергая их воздействию каждой комбинации стимула и вознаграждения в общей сложности три раза.

Для проведения экспериментального теста поместите свежие контейнеры с запахами — по одному для каждого стимула — на противоположные стороны чашки Петри без специального покрытия. Перенесите обученных животных в центр чашки. Закройте крышку и подождите пять минут.

Через пять минут с помощью шаблона, расположенного под чашкой и четко определяющего три зоны (левую, правую и среднюю), подсчитайте количество личинок в каждой зоне. Средняя зона считается результатом отсутствия предпочтения, что делает анализ более строгим и менее подверженным систематической ошибке. Наконец, чтобы завершить эксперимент, выберите 30 новых личинок третьегоvстадии питания и повторите обучение и тестирование с противоположной комбинацией поощрения и стимулов.

Продолжайте использовать те же контейнеры с запахами. Для определения того, сохраняется ли у трансгенных животных нормальная обработка одорантов в отношении поощряющих стимулов, необходимо провести несколько контрольных тестов. Тест на предпочтение запаха у наивных особей начинается со сбора и промывки 30 личинок, как это было сделано при обучении и тестировании.

Затем поместите личинок в чашку Петри с агарозой, в которой с одной стороны находится только один флакон со стимулом. Закройте крышку и подождите пять минут. После этого, используя шаблон, подсчитайте количество личинок на ближней стороне, посередине и на дальней стороне чашки относительно стимула.

Проведите этот тест для каждого стимула, используемого в эксперименте, чтобы проверить предпочтение сахара у наивных особей. Подготовьте чашки Петри с двумя типами среды, вырезав половину агарозы в стандартной чашке и заполнив свободное пространство расплавленной агарозой другого типа. Следите за тем, чтобы объемы обеих половин совпадали и между ними не образовалось четкой границы.

Это может потребовать практики с использованием подготовленной чашки Петри, находящейся при комнатной температуре, в которую помещают 30 наивных, очищенных от корма особей. Третью группу личинок помещают в центр чашки. Закройте крышку и подождите пять минут.

Затем, используя шаблон, подсчитайте количество личинок с каждой стороны и количество личинок в центре. Описанная процедура использовалась для обучения и тестирования trenchgenic личинок. С использованием примеров стимулов данные подсчитывались как количество личинок в различных областях чашек Петри.

По истечении пяти минут после данного предпочтения данных были рассчитаны индексы, и на основе групп с взаимным обучением были выведены показатели эффективности. Поскольку тестируемые личинки были трансгенными, им также предлагался выбор между наполненным контейнером с запахом и воздухом, а также между чистыми ароматами и ароматами с добавлением сахара. Анализ рассчитанных индексов с помощью диаграммы размаха показал, что животные смогли научиться различать один октанол от ML ацетата, используя фруктозные ароматы в качестве аппетитного подкрепления.

Животные распознали оба стимула как аттрактанты и проявили изначальное предпочтение аромата фруктозы перед аэро. Эта экспериментальная парадигма успешно применялась с широким спектром ольфакторных и визуальных стимулов, а также с разнообразными поощряющими и наказывающими стимулами. Данная парадигма в сочетании с многочисленными мощными методами генетических манипуляций, доступными для drosophila, особенно полезна при анализе нейронных сетей; например, путем генетического воздействия на определенные группы нейронов, определенные паттернами экспрессии gal four, можно оценить функциональную роль этих нейронов в обучении аппетиту.

Данную процедуру в сочетании с генетическим вмешательством в функции нейронов можно использовать для анализа нейронных сетей мозга личинки, участвующих в процессах обучения и памяти. Благодаря простому строению мозга личинки такой анализ может быть проведен вплоть до уровня отдельных клеток.