Выделение, характеристика и сравнительный Дифференциация по правам зубных стволовых клеток, полученных из целлюлозы постоянных зубов с помощью двух различных методов

Общая цель данной процедуры заключается в выделении, характеристике и дифференцировке стволовых клеток пульпы зубов человека из постоянных зубов с использованием двух методов. Это достигается путем сбора здоровых ретинированных зубов мудрости и их первоначального распила по линии соединения цемента и эмали. Стволовые клетки пульпы зубов (D PSCs) выделяют двумя различными методами.

В первом методе ткани полипов подвергаются ферментативному перевариванию путем инкубации в растворе коллагеназы первого типа и растворе для межпозвонкового пространства. Далее мы будем называть этот метод ed. В случае с методом выделения во втором методе ткани полипов помещаются в колбу без предварительного переваривания.

Таким образом, dpss начинают мигрировать из ткани в колбу. Эти клетки, обозначенные как OG, относятся к методу изоляции путем высаживания (outgrowth isolation). Вторым этапом процедуры является идентификация стволовых клеток с помощью проточной цитометрии.

Третьим этапом процедуры является индукция дифференцировки одонтобластов, а заключительным этапом — сравнительная оценка дифференцировки одонтобластов в двух группах с помощью окрашивания алым красителем и QBCR. Я, RA Kde из отделения стволовых клеток и developmental biology института Rian. Сегодня я продемонстрирую вам методы выделения, характеристики и сравнительной дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток человека с использованием двух подходов.

Здравствуйте, я доктор Резайан из Института Рио. Мы работаем над проектом, связанным со стволовыми клетками пульпы зуба человека. Эти клетки относятся к мезенхимальным стволовым клеткам, которые легко получить с минимальным болевым синдромом и низким уровнем травматичности.

Мезенхимальные стволовые клетки характеризуются способностью к пластичной адгезии, образованию колоний и многолинейным потенциалом дифференцировки. Здравствуйте, я доктор Ами с кафедры стволовых клеток. В нашем институте мы используем данную процедуру в лаборатории для выделения стволовых клеток с целью проведения исследовательских работ и их последующего применения.

В регенеративной медицине самым первым шагом при использовании данного источника стволовых клеток для будущей терапии на их основе является выбор оптимального протокола выделения стволовых клеток из тканей человека. Для достижения этой цели крайне важно изучить определенные аспекты поведения клеток при различных условиях выделения стволовых клеток. Сначала я выделю стволовые клетки пульпы зуба человека, используя либо ферментативную диссоциацию пульпы, либо метод эксплантации (вырастания стволовых клеток из имплантатов ткани).

Затем охарактеризуйте их и дифференцируйте в остеобласты. Итак, приступим. Сначала взвесьте и растворите коллагеназу I типа в PBS.

Затем профильтруйте их через шприцевой фильтр с порами 0.2 micron. Перенесите оба раствора в коническую пробирку. После этого добавьте pener и PBS для достижения конечной концентрации.

Перенесите здоровые зубы мудрости в лабораторию в холодном базовом растворе в стерильных условиях. Перед исследованием очистите поверхность зуба 70% ethanol. Убедитесь, что с поверхности зуба удален весь мусор.

Обрежьте зуб вокруг цементно-эмалевого соединения с помощью стерильного стоматологического диска, чтобы обнажить пульповую камеру. Следует учитывать, что процесс резания необходимо выполнять медленно, чтобы избежать перегрева тканей зуба. Затем аккуратно отделите пульпу от коронки, разрезая ткани пульпы на фрагменты размером один-два миллиметра с помощью скальпеля Скарпа.

Перенесите небольшие фрагменты тканей пульпы в 1 мл ферментного раствора и инкубируйте в течение одного часа при 37 °C, перемешивая на вортексе каждые 30 минут для облегчения распада тканей пульпы. После этого удалите крупные агрегаты, пропустив суспензию через клеточный стрейнер с размером пор 70 мкм. Затем добавьте PBS, содержащий PENER, и центрифугируйте при 1 200 об/мин в течение пяти минут.

Осторожно удалите супернатант. Затем суспендируйте клетки на планшете в пролиферационной среде pm, перенесите их в культуральный флакон и добавьте среду. После этого проведите инкубацию.

Меняйте среду каждые три дня до достижения конфлюэнтности клеток для метода культивирования. Повторите процесс измельчения. Под измельчением зуба подразумевается разделение тканей на фрагменты размером от 1 до 2 мм.

Затем поместите их в культуру. Добавьте питательную среду для пролиферации и инкубируйте. Следует учитывать, что общий объем среды для пролиферации должен быть достаточным для обеспечения прикрепления всех фрагментов для дальнейшего разрастания клеток.

Замените среду после наблюдения разрастания клеток, а затем каждые три дня до достижения конфлюэнтности. Для иммунофенотипирования инкубируйте оба типа D PSCs с антителами, конъюгированными с PE или FITC, в течение 30 минут при четырех градусах Celsius в темноте. Затем добавьте PBS и центрифугируйте при 1 200 RPM в течение пяти минут.

Удалите супернатант, ресуспендируйте клетки на планшете в PBS и в завершение оцените поверхностные маркеры с помощью проточного цитометра. Проведите субкультивирование обоих типов DPCs в течение трех пассажей. Затем обработайте клетки трипсином на льду и перенесите их в шесть красных культуральных чашек с плотностью посева 60%. Замените PM на одонтогенную среду. Три лунки оставьте в качестве отрицательного контроля, добавив в них PM.

Меняйте среду каждые три дня; на 21-й день промойте клетки PBS. Затем зафиксируйте их, добавив в каждую лунку по 1 мл 10% формальдегида на 15 минут при комнатной температуре.

Через 15 минут осторожно удалите фиксатор и трижды промойте клетки дистиллированной водой. Затем замените воду 1 мл раствора красителя Alza Red. Через 20 минут удалите излишки красителя и четырежды промойте клетки деионизированной водой.

Затем в каждую лунку добавьте 1 мм воды, чтобы предотвратить высыхание клеток. После окрашивания под микроскопом можно увидеть, что три верхних ряда стали красными по сравнению с контролем; при большом увеличении можно наблюдать поглощение красителя вокруг клетки для количественной оценки красного окрашивания. После удаления воды добавьте в каждую лунку 1 мл 10% уксусной кислоты, затем инкубируйте в течение 30 минут при перемешивании.

Затем осторожно снимите клетки с планшета с помощью скребка для клеток. Перенесите их в отдельные пробирки. Интенсивно перемешивайте в течение 30 секунд.

Затем нагрейте их до 85 °C в течение 10 минут. Чтобы избежать испарения, закройте пробирки пленкой ParaView, выдержите на льду пять минут, затем центрифугируйте при 20 000 G в течение 15 минут. Тем временем приготовьте серийные разведения стандарта Alizarin red в соответствии с протоколом региона.

После центрифугирования снимите супернатант и перенесите его в новые пробирки. Нейтрализуйте pH 10% гидроксидом аммония. Затем внесите стандарты и образцы в 96-луночный планшет.

Разлейте раствор по лункам планшета, затем измерьте оптическую плотность при 405 нм и проанализируйте данные в соответствии со стандартным серийным разведением. Здесь представлены DPSCs, выделенные путем ферментативной диссоциации на 10-й, 15-й и 18-й дни, а также outgrowth DPSCs на 5-й, 10-й, 13-й и 18-й дни. Оба типа DPSCs в фазе три имеют практически одинаковый размер и морфологию. Результаты иммунофенотипирования показывают наличие маркеров мезенхимальных стволовых клеток, таких как CD 44, CD 73 и CD 19, и отсутствие гемопоэтических и эндотелиальных маркеров, таких как CD 34, CD 45 и CD 11 B. Интересно, что экспрессия CD 105 и CD 146 выше у outgrowth DPSCs по сравнению с DPSC-ED; количественный анализ окрашивания Alizarin Red на 21-й день дифференцировки одонтобластов показывает большее отложение кальция в DPSC-ED по сравнению с кондиционированными стволовыми клетками зуба.

Результаты QPCR также указывают на значительно более высокую экспрессию MEP и ALP как маркеров минерализации в D-P-S-C-D по сравнению с исходными стволовыми клетками зуба. В то же время оба гена регулируются в процессе дифференцировки, а экспрессия DSPP как одонтогенного маркера возрастала по мере дифференцировки. Однако в дифференцированных клетках групп ED и OG не наблюдалось значительных различий в экспрессии DSVP.

Мы только что продемонстрировали вам способы выделения стволовых клеток пульпы зуба человека с помощью либо ферментативной диссоциации пульпы, либо высева стволовых клеток из экспланта ткани. На этом всё. Желаю вам удачи в применении данной методики в ваших экспериментах.

Спасибо.