Высокое содержание изображений Workflow по изучению Grb2 сигнализации комплексы выражением Клонирование

Общая цель данного эксперимента заключается в идентификации партнеров по взаимодействию с белком grab two с помощью экспрессионного клонирования кДНК и наблюдения за изменениями grab two, меченного зеленым флуоресцентным белком. Для достижения этой цели на втором этапе подготавливают библиотеку кДНК из бактериальных лизатов. Затем кДНК трансфицируют в клетки эмбриональной почки человека, что приведет к экспрессии репортерной конструкции вместе с интересующими генами.

Затем трансфецированные планшеты анализируют на микроскопе Opera для визуализации изменений локализации Grb2 в клетках; в результате с помощью флуоресцентной микроскопии обнаруживается привлечение меченого GFP Grb2 в эндосомы, опосредованное рецептором эпидермального фактора роста. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими, такими как дрожжевая двугибридная система, является возможность идентификации партнеров по взаимодействию Grb2 в физиологических условиях с учетом их субклеточного распределения.

Хотя данный метод может быть использован для идентификации передачи сигнала с помощью Grab two, он также применим к другим системам, например, к другим интересующим белкам. Библиотека кДНК представлена в виде отдельных бактериальных клонов в стоках с глицерином.

В 96-луночном формате, используя команду re ray в меню пипеттора Hudson Rapid pick light, перенесите бактериальные клоны с исходного планшета и инокулируйте их в 1.5 milliliters lb amp в 96-луночном глубокодонном планшете. Плотно закройте глубокодонные планшеты газопроницаемой мембраной и инкубируйте в течение ночи при 37 °C в шейкере. На следующий день центрифугируйте глубокодонные планшеты с бактериями при 2000 RPM в течение 20 минут.

Используя адаптеры для планшетов в настольной центрифуге, аспирируйте среду из лунок, сохранив бактериальный осадок. Затем настройте рабочую поверхность автоматизированной станции Tecan Freedom Evo, как показано здесь. Распределите растворы для подготовки плазмид по кюветам с первого по пятое и установите планшет с глубокими лунками на рабочую поверхность.

Поместите многолуночный кювет с раствором алюциана рядом с планшетом с глубокими лунками, установите наконечники в штативы. Соберите вакуумный коллектор. Планшет для связывания плазмид помещают внутрь коллектора, а планшет с фильтрами для плазмид устанавливают поверх коллектора. Ресуспендируйте осадки в 250 µL раствора один.

Добавьте буфер для ресуспендирования Resus, перемешивая содержимое пипетированием вверх-вниз. Полное ресуспендирование осадка имеет критическое значение для успешного выполнения данной процедуры. Если пипетирование вверх-вниз не обеспечивает полного ресуспендирования осадка, можно использовать шейкер.

После полного ресуспендирования осадка проведите лизис бактерий, добавив 250 µL буфера для лизиса. Закройте планшет и переверните его для полного перемешивания. Установите таймер на две минуты.

Затем добавьте 350 µL раствора три — нейтрализующего буфера. Закройте планшет и переверните его трижды.

Перенесите бактериальные лизаты в фильтрующие планшеты для плазмид. Создайте вакуум на пять минут. Извлеките фильтрующий планшет и установите планшет для связывания на манифольд.

Создайте вакуум на одну минуту. Добавьте 500 µL дополнительного промывочного буфера и создайте вакуум на две минуты. Добавьте 900 µL промывочного буфера №4 и создайте вакуум на две минуты.

После этого снова добавьте 900 мкл промывочного буфера четыре и создайте вакуум на 15 минут. Поместите планшет для сбора ДНК в манифольд. Добавьте 100 мкл буфера для элюции в планшет для связывания и инкубируйте в течение двух минут.

Создайте вакуум на 10 минут. В завершение извлеките собирающую пластину и измерьте концентрацию ДНК с помощью NanoDrop 8, 000. При использовании данного метода для начала этой процедуры обычно можно ожидать выход около 100 nanograms per microliter.

После трипсинизации и подсчета клеток HEC-2-9-3 с помощью автоматического диспенсера внесите 2 × 10⁴ клеток в каждую лунку планшета Perkin Elmer View. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C и 5% CO2 перед проведением трансфекции.

Используйте автоматический диспенсер жидкостей для приготовления в каждой лунке 96-луночного планшета с круглым дном следующей смеси: 100 ng GFP. Возьмите две плазмидные ДНК с 100 ng CD NA в 25 µl безсывороточной среды. Затем добавьте в каждую лунку 25 µl безсывороточной среды, содержащей 0,5 µl трансфектина, перемешайте и запустите таймер на 30 минут.

Через 30 минут перенесите 50 µL смеси для трансфекции кДНК в клетки, используя метод аккуратного дозирования. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C и 5% CO2.

Для начала получения изображений запустите программное обеспечение Opera. Перейдите на вкладку конфигурации (configuration), выберите объектив 20х и соответствующий тип планшета. Убедитесь, что кольцо коррекции на объективе установлено на правильное значение для обеспечения фокусировки с различными типами планшетов.

Затем выберите вкладку микроскопа. Установите первую экспозицию (exposure one) как fite 4 88 laser, а вторую экспозицию (exposure two) — как UV 365 laser. Активируйте УФ-фильтр для обеих экспозиций и назначьте экспозицию.

Первый канал — для первой камеры и экспозиции. Второй — для второй камеры. Установите время экспозиции на 800 миллисекунд для первой экспозиции и 40 миллисекунд для второй.

Во-вторых, выберите экспозицию, установите высоту фокуса на ноль микронов. После достижения фокуса выберите «фокус». Сделайте снимок камерой один.

Отрегулируйте высоту фокуса, чтобы оптимизировать плоскость экспозиции, и нажмите кнопку «take height». Сохраните параметры экспозиции, затем повторите процедуру для экспозиции два. Перейдите на вкладку определения эксперимента (experiment definition), создайте макет (layout) и подмакет (sub layout).

Перетащите и поместите соответствующие файлы макета, экспозиции, эталонного изображения, перекоса, обрезки и подмакета. Сохраните эксперимент. Выберите вкладку автоматического эксперимента и выполните захват изображений в нормальных условиях.

Белок Grab 2 локализован по всей клетке. При стимуляции рецептора фактора роста он перемещается к плазматической мембране и впоследствии интернализуется в эндосомы. На этом рисунке на верхней панели показаны клетки CO M six, транзиторно трансфекционированные GFP-Grab 2; как и ожидалось, флуоресценция распределена по всей клетке.

Однако в клетках, транзиентно трансфицированных GFP-Grb2 и клеточным поверхностным рецептором EGFR, Grb2 перемещается в эндосомоподобные структуры, что показано на нижней панели. Таким образом, при использовании общегеномной библиотеки можно ожидать идентификации новых поверхностных белков клеток, связывающихся с Grb2. Данный метод не ограничен только детектированием поверхностных белков клеток.

Например, белок DYNAMIN two из семейства ГТФаз (GPA), участвующий в эндоцитозе, опосредованном белком grab two, индуцирует транслокацию grab two. В данном эксперименте клетки HEC 2 93 T были ко-трансфицированы GFP grab two и DNM two. Перемещение GFP grab two в эндосомоподобные структуры показано клетками, обведенными красными кругами.

После выполнения данной процедуры можно использовать другие методы, такие как иммунопреципитация или биохимический анализ, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, является ли взаимодействие прямым или косвенным. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как использовать экспрессионное клонирование для идентификации субклеточных белковых взаимодействий.