Подготовка и инактивации болезнетворных микроорганизмов из продуктов Double Dose Buffy Coat тромбоцитов помощью перехвата системных крови

В данном видео будет подготовлен двухдозовый тромбоцитарный концентрат из пула семи баффи-котов с последующей обработкой препаратом Intercept. После просмотра этого видео вы получите четкое представление о том, как производить патогенин-инактивированный двухдозовый тромбоцитарный концентрат. Сначала мы представим схематический обзор, после чего последует демонстрация.

Первые семь единиц донорской цельной крови центрифугируют и разделяют для получения семи единиц лейкоцитарного слоя, соответствующих целевым показателям объема и гематокрита. Содержимое лейкоцитарных слоев объединяют и центрифугируют. Затем суспензию тромбоцитов отделяют от остаточных эритроцитов для получения двойной дозы концентрата тромбоцитов с целью инактивации патогенов и лейкоцитов.

Концентрат тромбоцитов в двойной дозе обрабатывается с помощью системы Intercept, которая осуществляет кросс-линкинг нуклеиновых кислот. В итоге эта процедура позволяет получить две терапевтические дозы тромбоцитов с приемлемым качеством in vitro в течение семи дней хранения, что определяется путем оценки pH, уровня глюкозы, лактата, PO₂ и PCO₂, а также количества тромбоцитов. Техник из центра крови продемонстрирует выполнение процедуры, а мы опишем требования к обработке.

Сначала убедитесь, что двойная доза тромбоконцентрата соответствует техническим характеристикам перехватывающей обработки: объем от 300 до 420 мл, доза тромбоцитов от 2,5 до 7 × 10¹¹ и содержание эритроцитов менее 4 × 10⁶ на мл. Начните данную процедуру с семи единиц цельной крови, собранных в наборы для сбора объемом 450 мл.

Поместите единицы крови в центрифужные стаканы и проведите интенсивное центрифугирование при 4 880 RCF в течение 11 минут при комнатной температуре с установкой торможения B five согласно инструкциям производителя. После центрифугирования кровь разделится на три слоя: эритроциты, лейкоцитарный слой (баффи-коут) и плазму. Перенесите плазму в верхний сателлитный пакет, а эритроциты — в нижний сателлитный пакет, оставив лейкоцитарный слой объемом примерно 48 мл и с гематокритом 37% в контейнере для сбора.

Поместите лейкоцитарные слои на шейкер для тромбоцитов при комнатной температуре на ночь, используя стерильное соединение для семи лейкоцитарных слоев и 300 миллилитров SSP с раствором для добавления к тромбоцитам. В конфигурации для слива, при которой раствор для добавления находится сверху, зажмите трубку между раствором для добавления и первым лейкоцитарным слоем, как показано здесь. Вскройте сварочные швы между единицами лейкоцитарных слоев и дайте им стечь в последний контейнер с лейкоцитарным слоем.

Затем откройте зажим и соединение между аддитивным раствором и первой порцией лейкоцитарного слоя, позволяя примерно одной трети аддитивного раствора (около 100 мл) последовательно промыть каждый контейнер с лейкоцитарным слоем перед закрытием зажима; повторите промывку еще два раза, каждый раз используя примерно 100 мл аддитивного раствора. Отсоедините общий контейнер с лейкоцитарным слоем от пустых контейнеров. Общий объем лейкоцитарного слоя, включая аддитивный раствор, должен составлять примерно 600 мл.

Поместите объединенные лейкоцитарные слои на встряхиватель на один час при комнатной температуре. Затем подсоедините контейнер для хранения тромбоцитов с встроенным фильтром для лейкоредукции к пакету с объединенными лейкоцитарными слоями. Поместите объединенные лейкоцитарные слои и контейнер для хранения тромбоцитов в центрифугу и центрифугируйте при 462 RCF в течение девяти минут и 20 секунд.

После центрифугирования перелейте суспензию тромбоцитов через фильтр для редукции лейкоцитов Luca в контейнер для хранения тромбоцитов. В результате получается двойная доза тромбоцитарного концентрата, содержащая примерно 7 × 10¹¹ тромбоцитов в 420 миллилитрах, который может быть подвергнут инактивации патогенов с помощью системы Intercept. Двойная доза тромбоцитарного концентрата обрабатывается с использованием набора для обработки Intercept, который состоит из контейнера для добавления реагента, контейнера для облучения и двух контейнеров для хранения.

Подсоедините контейнер с суспензией тромбоцитов к контейнеру с амином в системе для перехвата и обработки. Затем подвесьте тромбоциты. Сломайте нижнюю канюлю на контейнере с амином, чтобы раствор мог перетечь в контейнер для освещения.

Затем разломите верхнюю канюлю на контейнере с Amin, чтобы тромбоциты могли перетечь из контейнера Amin в контейнер для освещения. Осторожно перемешайте смесь тромбоцитов и аминозин. Слегка сожмите контейнер для освещения, чтобы удалить из него воздух.

Загерметизируйте трубку между контейнером для освещения и амато таким образом, чтобы из контейнера для освещения выступало не более четырех сантиметров трубки. Извлеките и утилизируйте пустые контейнеры. Поместите рабочий набор в осветитель, расположив контейнер для освещения в большом отделении слева, а органайзер — в меньшем отделении справа.

Отсканируйте идентификатор донатора. Код продукта и обработка. Введите номер лота в иллюминатор.

Закройте металлическую крышку и ящик. Нажмите кнопку запуска, чтобы начать облучение. Осветитель обеспечивает контролируемую дозу УФ-А излучения смеси тромбоцитов с аминами в контейнере для облучения.

Амин связывается с парами оснований нуклеиновых кислот патогенов, которые могут присутствовать в единице тромбоцитов. При освещении образуются необратимые поперечные сшивки, которые фиксируют ДНК или РНК, в результате чего патогены теряют способность к репликации и вызывать заболевание у реципиента компонента крови. После освещения извлеките набор для обработки.

Затем извлеките контейнеры из органайзера, подвесьте тромбоциты и набор для обработки. Отломите канюлю на выходе из контейнера для освещения и дайте тромбоцитам перетечь в контейнер CAD. Внутри контейнера CAD находится пластина с иммобилизованными макропористыми полистирольными гранулами, которые снижают уровень остаточного амина в препарате крови.

Следя за тем, чтобы не согнуть пластину CAD, вытесните воздух из контейнера CAD в контейнер для освещения. Герметизируйте трубку рядом с входным портом контейнера CAD.

Снимите и утилизируйте пустой контейнер для освещения. Поместите CAD-контейнер с прикрепленными к нему контейнерами для хранения на шейкер для тромбоцитов на период от 6 до 16 часов. Это приведет к снижению остаточного содержания амлина до концентрации менее или равной 2 µM.

После обработки методом CAD извлеките единицы тромбоцитов из перемешивающего устройства, подвесьте тромбоциты, отломите канюлю на выходе из контейнера CAD и дайте тромбоцитам перетечь в два контейнера для хранения. Затем удалите воздух из контейнеров для хранения. Перекройте трубку выше Y-образного соединителя и снимите контейнер CAD.

В результате были получены два концентратa тромбоцитов с инактивированными патогенами для оценки функции тромбоцитов in vitro. Определялись доза тромбоцитов, pH, PO₂, лактат, продукция и потребление глюкозы в интерцепте. Анализ концентратов тромбоцитов проводился на протяжении семи дней хранения.

На этом рисунке показана средняя начальная доза тромбоцитов в двойной дозе тромбоцитного концентрата до обработки перехватным методом, а также средняя доза тромбоцитов в каждом из обработанных разделенных продуктов в течение семи дней хранения. Как видно здесь, потеря тромбоцитов во время хранения составила приблизительно 9%. Это снижение не отличается от ожидаемой потери тромбоцитов при хранении обычных тромбоцитов. Согласно европейским требованиям, pH тромбоцитов должен оставаться выше 6,4 до конца срока годности.

В процессе обработки pH тромбоцитарных концентратов немного снижается в зависимости от объема концентрации тромбоцитов и газопроницаемости контейнера для хранения тромбоцитов. На данном рисунке показано значение pH разделенных тромбоцитарных продуктов в течение семи дней хранения; в этот период pH остается стабильным и поддерживается в пределах требований к обработке. В хранимых тромбоцитах должен продолжаться аэробный метаболизм, который служит показателем способности тромбоцитов функционировать in vivo после переливания пациенту.

Потребление O2 и выработка CO2 тромбоцитами свидетельствуют о продолжающемся дыхании тромбоцитов в контейнере PL 24 10 в течение семи дней хранения. Аналогично, в хранимых тромбоцитах должен продолжаться анаэробный метаболизм. Таким образом, потребление глюкозы и выработка лактата также являются показателями способности тромбоцитов функционировать после трансфузии.

На этих двух рисунках показаны уровни лактата и глюкозы в течение семи дней хранения. Потребление глюкозы и выработка лактата тромбоцитами согласуются друг с другом. За семь дней хранения в пяти единицах уровень глюкозы составил менее 1,11 ммоль/л, что является нижним пределом анализа на глюкозу.

Подготовка и валидация объединения лейкоцитарных слоев (buffy coat) позволили получить концентраты тромбоцитов, соответствующие входным критериям для обработки методом интерцепции, в частности по объему, количеству тромбоцитов, соотношению плазмы и загрязнению эритроцитами. Конечные единицы соответствуют критериям валидации в течение семи дней хранения, включая дозу тромбоцитов и pH. Основным преимуществом данной методики по сравнению с традиционным методом подготовки лейкоцитарного слоя, при котором получается концентрат тромбоцитов в одной дозе, является максимизация выхода компонентов из collected крови, снижение эксплуатационных расходов за счет использования метода двойной дозы и повышение безопасности пациентов путем инактивации патогенов, передающихся при трансфузии.