Получение клеточных линий для условных нокдаун экспрессии генов и измерения нокдаун влияние на E4orf4-индуцированной гибелью клеток

Общая цель следующего эксперимента заключается в изучении влияния нокдауна ACF1 или SNF2H на индуцированную E4 или 4 гибель клеток. Это достигается путем создания клеточных линий, в которых экспрессия srna ACF1 или SNF2H conditionally активируется добавлением доксициклина, что на втором этапе приводит к снижению уровней белка ACF1 или SNF2H. Полученные клеточные линии обрабатывают доксициклином для снижения экспрессии ACF1 или SNF2H либо оставляют без обработки.

Далее E4orf4 экспрессируют в клетках с shRNA-резистентными ACF1 или SNF2H или без них. Чтобы исследовать влияние ACF1 или SNF2H на индуцированную E4orf4 гибель клеток, были получены результаты, демонстрирующие воздействие уровней ACF1 или SNF2H на токсичность E4orf4 на основании подсчета ядер с апоптотической морфологией с использованием анализа JY. Основным преимуществом данного метода по сравнению с другими, такими как транзиентная трансфекция РНК, является то, что shRNA экспрессируется во всех клетках, и процент клеток, коэкспрессирующих её вместе с традиционной плазмидой, выше. Этот метод позволяет глубже понять механизмы, лежащие в основе индуцированной E4orf4 гибели клеток, но он также может быть применен для изучения других проapoptotic белков.

Помимо Аны Лафе, некоторые части данной процедуры продемонстрирует исследователь из моей лаборатории. Для начала процедуры по созданию индуцибельных клеточных линий высейте клетки T-Rex 2 9 3 с плотностью около 5×10⁶ клеток на чашку 10 см в 8 мл среды DMEM, содержащей сыворотку без тетрациклина и 5 µg/mL бластоцидина; инкубируйте чашки в течение ночи при 37 °C и 5% CO2. На следующий день перед трансфекцией замените среду на 8 мл свежей среды. Плазмидой для трансфекции является плазмида P superior neo plus GFP, кодирующая ACF1 или SNF2 H-S-H-R-N-A под управлением тетрациклин-индуцибельного промотора H1, а также ген устойчивости к неомицину, слитый с GFP и находящийся под управлением конститутивного промотора PGK.

Добавьте 10 µg плазмидной ДНК в 500 µL 150 mM раствора хлорида натрия и перемешайте на вортексе. Затем в отдельную пробирку с 500 µL 150 mM раствора хлорида натрия добавьте реагент jet PY из расчета 2 µL на 1 µg ДНК и перемешайте на вортексе. Добавьте раствор jet pie к ДНК и тщательно перемешайте с помощью вортекса.

Инкубируйте смесь при комнатной температуре в течение 15 минут. По истечении 15 минут осторожно перенесите пипеткой ДНК-комплексы на чашки диаметром 10 сантиметров, содержащие клетки T-Rex 2 9 3 с конфлюэнтностью 70–80%, которые были высеяны накануне.

Замените среду на селективную среду (в данном примере, как и прежде, DMEM), содержащую 500 µg/mL G418. В течение следующих двух недель наблюдайте за клетками. Каждые три-четыре дня заменяйте селективную среду на аналогичную свежую среду до появления колоний.

Визуально определите колонии и отметьте их расположение на дне чашки с помощью цветного маркера. Под микроскопом убедитесь, что колонии хорошо отделены друг от друга. Колонии можно изолировать, когда они достигнут размера, позволяющего видеть их без микроскопа.

Для успешного выполнения данной процедуры при изоляции колоний важно выбирать хорошо отделенные друг от друга колонии. В стерильном боксе аспирируйте среду из чашки. Осторожно промойте PBS и тщательно аспирируйте всю оставшуюся жидкость.

Добавьте 3 µL 0,25% раствора трипсина в EDTA на одну колонию на планшете, многократно аккуратно распределяя раствор пипеткой до тех пор, пока клетки не открепятся от поверхности. Перенесите клетки в селективную среду в лунку 24-луночного планшета. Повторите эту процедуру для нескольких других колоний на планшете.

Культивируйте клетки при 37 °C в атмосфере 5% CO2 до заполнения лунки. Затем распределите клетки из каждой исходной колонии по трем лункам в отдельный 12-луночный планшет и инкубируйте их в течение ночи. На следующий день замените среду в одном планшете на среду, содержащую 1 µg/mL доксициклина из стокового раствора, приготовленного на дважды дистиллированной воде.

Замените среду в контрольной лунке на среду без доксициклина. Инкубируйте клетки при 37 °C в атмосфере 5% carbon dioxide в течение 72 часов. Затем клетки из одной обработанной и одной необработанной лунки собирают для вестерн-блот-анализа с целью определения эффективности нокдауна ACF one или SNF two H; здесь представлен репрезентативный результат.

Этот блот был окрашен антителами к SNF2H и альфа-тубулину. Последний использовался в качестве контроля нагрузки для двух клонов. Клоны номер четыре и номер пять продемонстрировали сильное снижение экспрессии SNF2H после индукции доксициклином и, следовательно, были выбраны для использования в эксперименте по нокдауну, который будет продемонстрирован в следующем сегменте.

Необработанные клетки на третьей планшете будут использованы для экспансии выбранной клеточной линии, после чего аликвоты этих клеток будут заморожены. Для последующего индуцирования нокдауна ACF1 или SNF2H в клетках, находящихся в селективной среде на 10-сантиметровых планшетах, добавьте доксициклин в концентрации 1 µg/mL в половину планшетов и инкубируйте при 37 °C и 5% CO2 в течение 48–72 часов. Каждая группа планшетов должна обеспечить количеством клеток для 12 шестисантиметровых планшетов, включая два дубликата для анализа DPI для каждой точки, а также один планшет для вестерн-блот-анализа каждого образца.

Через 48–72 часа после индукции обработайте клетки каждой группы трипсином, подсчитайте их и высейте в количестве 1,5 × 10⁶ клеток на чашку диаметром 6 см в той же среде с добавлением или без добавления доксициклина. Инкубируйте клетки при 37 °C в атмосфере 5% CO2 в течение ночи; на следующий день проведите трансфекцию клеток согласно указаниям.

Как необработанные, так и обработанные доксициклином клетки трансфецируют в трех повторностях четырьмя способами. Первый вариант — с пустым плазмидным вектором и плазмидой, экспрессирующей GFP; второй — с пустым плазмидным вектором, а также вектором, экспрессирующим SHRA-резистентные ACF1-GFP или SNF2H-GFP; третий — с плазмидой, кодирующей E4, или с плазмидой, экспрессирующей GFP; и четвертый — с плазмидой, кодирующей E4, и вектором, экспрессирующим SHRA-резистентные ACF1-GFP или SNF2H-GFP. После трансфекции все планшеты инкубируют при 37 °C и 5% carbon dioxide в течение ночи.

На следующий день после трансфекции клеток экстрагируйте белки из одного планшета для каждого образца для проведения вестерн-блот-анализа, чтобы подтвердить эффективный нокдаун ACF one или SNF two H, а также равную экспрессию E four или four в различных образцах. Остальные 16 планшетов будут использованы для анализа DPI. Аспирируйте среду из планшетов, предназначенных для анализа DPI, и осторожно промойте клетки PBS в вытяжном шкафу.

Добавьте 1 mL 4% параформальдегида, приготовленного в PBS, чтобы полностью покрыть клетки, и инкубируйте в течение 15 минут при комнатной температуре без встряхивания. Отсосите параформальдегид и промойте клетки PBS, встряхивая при комнатной температуре в течение пяти минут. Повторите промывку еще дважды (всего три промывки), после чего перенесите образцы в 80% этанол, хранящийся при -20 °C, и инкубируйте при -20 °C не менее одного часа.

Отосшруйте этанол и дважды промойте клетки фосфатно-солевым буфером (PBS) при комнатной температуре, перемешивая в течение пяти минут при каждой промывке; затем однократно промойте клетки в течение пяти минут при комнатной температуре буфером PBS, содержащим 0.5% BSA и 0.05% Tween 20 (PBSBT). Промывку также следует проводить при перемешивании для предотвращения неспецифического связывания антител. Проведите блокировку клеток в одном миллилитре буфера PBSBT, содержащего 10% сыворотки козы, в течение 20 минут при перемешивании при комнатной температуре.

Затем дважды промойте клетки в P-B-S-B-T, по пять минут на каждую промывку. Инкубируйте клетки с первичным антителом (в данном случае специфическим антителом к E4 или 4) в 1 мл P-B-S-B-T в течение одного часа при комнатной температуре в условиях перемешивания. Затем промойте дважды в P-B-S-B-T и один раз в PBS, содержащем 0,1% BSA, по пять минут на каждую промывку.

Затем добавьте к клеткам 1 mL PBS с 0,1% BSA, содержащего соответствующее вторичное флуоресцентно-меченое антитело и DPI в конечной концентрации 0,5 µg/mL. Инкубируйте в течение 40 минут при комнатной температуре в темноте при перемешивании. В завершение промойте PBS в течение пяти минут.

Высушите лунку путем аспирации и держите планшеты в перевернутом виде еще один час или в течение ночи до полного высыхания, затем накройте алюминиевой фольгой; закрепите покровные стекла на клетках, используя раствор Flora Mount G. Храните планшеты при температуре 4 °C в темноте до начала подсчета. Апоптотические ядра клеток, подвергшихся различным воздействиям, описанным в протоколе, были фиксированы и окрашены специфическими антителами к E4 или 4 и DPI для визуализации ядер трансфицированных клеток.

На этом рисунке представлен пример клеток, экспрессирующих E four or four и GFP. На панели A показана контрольная экспрессия одного лишь белка GFP, а на панели B — экспрессия E four or four. Окрашивание ядер DAPI представлено на панели C, а совмещенные изображения — на панели D. Белыми стрелками отмечены трансфицированные GFP и E.Four or four клетки, содержащие ядра с морфологией апоптоза. Красными стрелками отмечены ядра неправильной формы, которые не учитывались как апоптотические ядра; звездочками отмечены митотические ядра или ядра, которые только что разделились. Количество конденсированных или фрагментированных ядер, визуализированных с помощью окрашивания DAPI, подсчитывалось для расчета процента ядер с морфологией апоптоза в популяции трансфицированных клеток с целью обеспечения оптимальной объективности анализа.

Подсчет апоптотических ядер в различных образцах проводился слепым методом, при котором лицо, выполнявшее подсчет, не знало состава образцов. Репрезентативный результат представлен на данном графике. Более высокий процент ядерных аномалий наблюдался в клетках, экспрессирующих E4orf4, что подтверждает тот факт, что E4orf4 индуцирует гибель клеток. Наивысший процент ядерных аномалий был отмечен в экспрессирующих E4orf4 клетках, в которых уровни ACF1 были снижены с помощью SHR-опосредованного нокдауна, что указывает на то, что нокдаун ACF1 усиливает индуцированную E4orf4 гибель клеток и повышает токсичность E4orf4 в клетках.

Низкий уровень экспрессии ACF не привел к повышению уровней E4 или 4, что было подтверждено методом вестерн-блоттинга. При выполнении данной процедуры важно обеспечить точный подсчет апоптотических ядер с помощью DPI и применять строгие критерии для идентификации таких ядер. В дополнение к этой процедуре для подтверждения результатов DA pse после завершения данной манипуляции могут быть проведены другие методы, такие как клоногенный анализ.

Для получения дополнительных ответов можно использовать другие методы, такие как коиммунопреципитация. Например, чтобы определить, существует ли физическое взаимодействие между исследуемыми белками.