Транс-естественных условиях отложенного типа анализа гиперчувствительности к антигену Специальное регулирование

Общая цель данной процедуры заключается в использовании транс-виво анализа реакции гиперчувствительности замедленного типа (DTH) для мониторинга как про-, так и противовоспалительных антигенспецифических ответов у людей. Сначала выделите мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) из периферической крови испытуемого. Затем смешайте препарат PBMC с PBS.

Антиген памяти (тестовый антиген) и смесь тестового антигена с антигеном памяти. Проведите предварительные измерения стоп и введите подготовленные смеси мышам линии SKID. Повторите измерения стоп через 24 часа. Три.

Характерные паттерны реакций ГЗР могут быть регуляторными, нерегуляторными или сенсибилизированными. Тест на транс-виво реакцию гиперчувствительности замедленного типа может быть применен для определения таких клинических параметров, как аллореактивные ответы, где источником антигена являются клетки донора трансплантата. Основным преимуществом данной методики перед существующими методами in vitro является возможность легко определить как провоспалительные, так и регуляторные ответы на аллоантигены, аутоантигены или опухолевые антигены с помощью одной системы анализа.

Эгон, исследователь в моей лаборатории, продемонстрирует процедуру. Используйте свежую периферическую кровь человека, собранную в пробирки с цитратом-декстрозой с добавлением кислоты, чтобы избежать активации тромбоцитов. Выделите PBMC с помощью среды для разделения лимфоцитов стандартными методами. Промойте препарат PBMC раствором PBS для удаления contaminating platelets.

При заметном загрязнении эритроцитами проведите лизис эритроцитов, используя лизирующий буфер CK. Затем выполните еще две промывки в PBS Resus. Суспендируйте PBMC в PBS до концентрации 10 миллионов PBMC на миллилитр для аллоантигена.

Начните с ПМК периферической крови, выделенных из периферической крови донора с использованием процедуры, описанной ранее. Затем суспендируйте клетки донора в PBS до концентрации 120 миллионов клеток на миллилитр и добавьте 1 мкМ PMSF для предотвращения деградации белков.

Теперь подвергните клеточную суспензию воздействию ультразвука, используя семь односекундных импульсов с помощью соникатора с зондом диаметром 2 мм. С помощью гемоцитометра подтвердите разрушение более 90% клеток.

Затем центрифугируйте смесь при 14 000 об/мин при температуре четыре градуса Цельсия в течение 20 минут. Осторожно перенесите супернатант в пробирку типа safe-lock и определите концентрацию белка для каждой инъекции стандартными методами. Разлейте по аликвотам 10⁶ PBMC в объеме 2 мл (семь раз).

С помощью центрифугирования в пробирках с безопасным замком осаждают клетки. Сначала приготовьте суспензию PBMC для отрицательного контроля в 35 µL PBS. Затем для положительного контроля добавьте 25 µL антигена памяти (столбнячного и дифтерийного анатоксинов) и доведите объем инъекции до 35 µL с помощью PBS.

Согласно плану эксперимента по оценке донор-специфического ответа, ресуспендируйте клеточный осадок в 10 µL донорского антигена и 25 µL PBS до общего объема 35 µL. Для оценки экспериментальной донор-антиген-специфической регуляции ресуспендируйте клеточный осадок до объема 35 µL, добавив 10 µL донорского антигена и 25 µL антигена реколл TT DT. После анестезирования мыши изофлураном поместите пружинный штангенциркуль в центр подушечки лапы так, чтобы один край касался последней опорной подушечки стопы; это послужит ориентиром для обеспечения единообразия места измерения после стабилизации показаний датчика.

Зафиксируйте исходную толщину подушечки лапы перед инъекцией. Расположите шприц так, чтобы игла была направлена в сторону пальцев, а срез иглы был обращен вверх. После этого приступайте к подкожному введению каждой клеточной суспензии в подушечки задних лап мыши.

Во-первых, медленно введите в подушечку правой лапы препарат отрицательного контроля. Затем введите в подушечку левой лапы положительный контроль, состоящий из PBMC и TT dt. После этого верните мышь в клетку.

Во-вторых, в правую подушечку стопы введите PBMC с аллоантигеном, а в левую — PBMC с аллоантигеном и TT dt. Убедитесь в отсутствии утечки через 18–24 часа после инъекции. Проведите анестезию каждой мыши изофлураном и повторно измерьте отек подушечки стопы.

Для определения величины отека стопы вычтите толщину каждой подушечки стопы перед инъекцией из значения после инъекции. Затем рассчитайте чистую величину антиген-специфического отека, вычтя значение отека контрольной стопы из значений отека стопы, полученных при применении исследуемых препаратов. Подтвердите показатели положительного контроля: ответ положительного контроля на антиген памяти TT DT должен быть больше или равен 25 × 10⁻⁴ дюймов.

Для того чтобы тест считался валидным, необходим фоновый ответ на PBS. Далее определите ингибирование реколл-ответов в присутствии донорских антигенов. В данном эксперименте оценивается специфический ответ на донорский антиген и регуляция у реципиентов почечного трансплантата.

Существует три основных паттерна гиперчувствительности замедленного типа у реципиентов трансплантатов: регуляторный, нерегуляторный и сенсибилизированный. Все пациенты продемонстрировали выраженную реакцию на положительный контроль — антиген памяти tt. У пациента номер 62 наблюдается регуляторный паттерн, который характеризуется слабой реакцией на донорский антиген и заметным связанным подавлением реакции на антиген памяти в присутствии донорского антигена.

Данный паттерн был определен как ассоциированный с толерантностью к аллотрансплантату органов. У пациента номер 48 наблюдается нерегуляторный паттерн, который характеризуется слабым ответом на донор, но отсутствием связанного с ним подавления. Этот паттерн часто наблюдается у пациентов, принимающих иммуносупрессивные препараты.

У пациента номер восемь наблюдается паттерн сенсибилизации к донору, характеризующийся высоким ответом на антиген донора и отсутствием связанного с ним подавления. Данный ответ ассоциирован с отторжением трансплантата. В клинических исследованиях случаев ПМК пациентов, включенных в наблюдательное исследование, анализировались на наличие специфического для донора ответа по непрямому пути, а также ответов Т-эффекторных и Т-регуляторных клеток для оценки роли донор-специфической регуляции в клинической толерантности.

Непрямые Т-клеточные ответы на донорские антигены демонстрируют отчетливый спектр различий между группами участников. Отек стопы увеличивается по мере того, как клинический статус пациента меняется от толерантного состояния к хроническому отторжению. В данном случае метод анализа связанного подавления позволяет измерить антидонорский непрямой путь Т-регуляторного ответа.

Эти данные демонстрируют снижение регуляторных ответов в диапазоне от наиболее толерантных пациентов через промежуточную группу к наименее толерантным пациентам с хроническим отторжением. В совокупности это указывает на то, что иммунная регуляция, измеренная с помощью анализа DTH trans vivo, представляется важным механизмом приживаемости аллотрансплантата почки.

Перспективной областью является применение анализа TDTH для мониторинга аутоиммунитета. Наше исследование роли коллагена V в патологическом процессе синдрома облитерирующего бронхиолита (BOS) показало, что наивысший относительный риск развития BOS наблюдался у пациентов с положительным ответом PBMC из легких реципиентов трансплантата на коллаген V, в то время как у здоровых контролей или при воздействии коллагена такой ответ отсутствовал.

У четырех пациентов с реактивным синдромом «хороших пастбищ» после трансплантации почек часто наблюдалась реактивность к коллагену V. Анализ TDTH также может быть использован для тестирования реактивности PBMC пациентов с онкологическими заболеваниями к опухолеспецифичным антигенам. Например, наличие Т-регуляторных клеток, специфичных к PAP, у пациентов с раком предстательной железы может ограничивать ответ на вакцинацию антигеном PAP.

Анализ TRANSVAAL DTH представляет собой новый диагностический тест, применяемый в клинике для оценки клеточного иммунного ответа у пациентов с трансплантатом, онкологическими и аутоиммунными заболеваниями. Его ценность заключается в том, что он полезен не только для мониторинга реколл-ответов эффекторных T-клеток, но и может быть использован для выявления регуляторных T-ответов, поскольку при обнаружении эффекторных или регуляторных T-клеток он не опирается на измерение конкретного цитокина. Данный метод отличается высокой гибкостью и широкой применимостью.