Экспериментальные человека перевозке пневмококковой
15 февраля 2013 г.
Экспериментальные человека перевозке пневмококковой предлагает естественную модель перевозки и потенциальной моделью для использования в разработке вакцины. Этот метод является ценным, но сложный и включает в себя клинические рисков путем введения возбудителя в организм человека. Мы разработали подробный протокол.
Целью данной процедуры является установление экспериментального носительства пневмококковой инфекции у человека. Это достигается путем предварительного разбавления и количественного определения бактерий в посевном материале. На втором этапе добровольцу интраназально прививают Streptococcus pneumoniae.
Затем добровольцу нужно промывать нос на второй, седьмой и 14-й день после прививки. Наконец, классическая микробиология используется для определения того, является ли доброволец носителем привитого оккула. В конечном счете, экспериментальное носительство пневмококковой инфекции человека может быть получено с помощью этого безопасного и воспроизводимого метода.
Основное преимущество данной методики перед существующими моделями мышиного носительства заключается в том, что данная методика предлагает модель носительства в естественном хозяине пневмококка – человеке. Кроме того, этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области пневмококковой инфекции, например, каковы иммунологические корреляты защиты? Каков иммунизирующий эффект носительства, и каково влияние давления хозяина на возбудителя в носоглоточной нише?
Применение этого метода включает его использование в качестве метода отбора новых пневмококковых вакцин. Мы планируем использовать профилактику носительства в качестве суррогата вакциноиндуцированного иммунитета. Клиническую технику продемонстрируют сестра Энджи Райт и старшая медсестра Дэвид Шоу.
За 30 минут до назначенного добровольного прививки пробирка с запасом инокулята, взятая из морозильной камеры при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Затем раскрутите инокулюм в микроцентрифуге в течение трех минут со скоростью 17 000 раз. G, пока трубка вращается, согрейте несколько кровяных агаровых тарелок в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия.
Затем извлеките отвар из инокулянта центрифуги, а гранулы промойте в одном миллилитре физиологического раствора. Повторите этап центрифугирования и промывки. Выполните набор разбавлений для желаемой концентрации инокулюма, а затем количественно измерьте количество бактерий в инокулюме методом миль и мисра.
Выросшие колонии станут видны уже на следующий день. Отнесите прививку добровольцу, который должен удобно усидеть в полулежачем положении. Затем с помощью P 200 perpe и стерильного фильтра наконечников.
Наберите 100 микролитров инокулюма в наконечник perpe и вставьте наконечник прямо в носовую полость. Медленно выведите инокулянт на слизистую оболочку носа круговыми движениями. Не располагайте наконечник пипетки слишком далеко назад, иначе инокулянт попадет в горло.
Повторите инокуляцию для других ноздряшек, чтобы избежать попадания бактерий в кровоток. Будьте осторожны, чтобы не нарушить слизистую оболочку пипеткой. Затем попросите добровольца оставаться в полулежачем положении в течение 10 минут, чтобы бактерии могли рассеяться по слизистой оболочке.
После введения инокулята добровольцам повторите количественное определение бактерий в лаборатории. Затем пометьте пробирку датой и дозой инокулята и храните инокулюм при температуре минус 80 градусов Цельсия. Перед началом промывания носа попросите добровольца удобно сесть, откинув голову назад на 30 градусов от вертикали.
Затем попросите добровольца сделать глубокий вдох и задержать его, одновременно проталкивая язык вверх и назад к нёбу. Попросите волонтера подать сигнал, когда эта позиция будет достигнута. Теперь четыре раза промойте носовую полость 20 миллилитрами физиологического раствора, выпуская по пять миллилитров физиологического раствора за один раз в переднее носовое пространство.
Пусть доброволец немедленно наклонится вперед и быстро выдохнет через нос в миску из фольги, чтобы вытолкнуть жидкость После каждого промывания пятью миллилитрами физиологического раствора. Промыв носовую полость четырьмя 20 миллилитрами, стяните все собранные образцы вместе в центрифужную пробирку. Теперь центрифугируйте добровольные образцы для промывания носа в течение 10 минут при 3,345 градусах Г. Удалите супинат и храните его в виде одного миллилитра аликвоты в маркированных пробирках эйнора при температуре минус 80 градусов Цельсия.
Добавьте в гранулу 100 микролитров среды STGG и тщательно перемешайте, а затем определите общий объем в пробирке. Следующая пластина, капля 20 микролитров ресуспендированной гранулы на кровяную агаровую пластину, содержащую гентамицин, и прорежьте всю пластину. Если промывание носа проводится после инокуляции, используйте 10 микролитров STGG, содержащего ресуспендированную гранулу.
Для количественного определения бактерий по методу Майлза и Мисра добавьте еще 800 микролитров STGG в зонд для промывания носа и тщательно перемешайте. Затем нанесите 25 микролитров раствора бактериальных клеток STGG на другую пластину с кровяным агаром и 25 микролитров на шоколадную агаровую пластину, пронизывая всю поверхность обеих пластин. Затем заморозьте оставшиеся бактерии в двух криопробирках при температуре минус 80 градусов Цельсия.
Инкубируйте пластины с температурой 37 градусов Цельсия в течение ночи в 5% углекислом газе. На следующий день осмотрите пластины на пневмококк и другие потенциальные респираторные патогены. Кровяные агаровые пластины, привитые носовыми полосами, могут быть трудными для чтения.
На этом изображении показан пример пластины, которую легко читать, а пневмококки хорошо видны. Однако эта пластина содержит много колонизирующей флоры, что затрудняет определение наличия пневмококков на каждом приеме. Добровольцев попросили описать любые симптомы со стороны верхних дыхательных путей, если они присутствуют, и было выделено сравнение между носителями и неносителями.
Из 145 человек, недавно привитых пневмококком, 28 жаловались на симптомы, обобщенные в этой таблице. Восемь из этих добровольцев были носильщиками, 20 – нет. Все жалобы были рассмотрены внешним комитетом по безопасности и после тщательного расследования.
Никаких симптомов пневмококковой инфекции не было. Наиболее распространенными симптомами были боль в горле, заложенность носа и гриппоподобное заболевание. При попытке выполнить эту процедуру важно иметь очень тщательный план безопасности, который охватывает каждый шаг метода, особенно для безопасности волонтеров.
После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как установить экспериментальное носительство пневмококковой инфекции человека, а также обнаружить носительство с помощью промывания носа.
Обзор
В данной статье представлен подробный протокол создания экспериментального носительства пневмококка у человека — модели, имеющей большое значение для разработки вакцин. Метод включает интраназальное введение Streptococcus pneumoniae с последующим мониторингом с помощью промываний носа.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Микробиология
- Иммунология
- Разработка вакцин
Теоретическая справка
- Экспериментальное носительство пневмококка у человека служит естественной моделью для изучения пневмококковых инфекций.
- Данный метод сопряжен с клиническими рисками из-за введения патогена в организм человека.
- Он обладает преимуществами по сравнению с мышиными моделями, позволяя изучать патоген в его естественном хозяине.
- С помощью этой модели можно ответить на ключевые вопросы пневмококковых исследований.
Цель исследования
- Разработать безопасный и воспроизводимый метод индукции носительства пневмококка у людей.
- Изучить иммунологические корреляты защиты и влияние носительства на организм хозяина.
- Способствовать отбору наиболее перспективных новых вакцин против пневмококка.
Используемые методы
- Приготовление бактериального инокулята методом разведения и количественного определения.
- Интраназальная инокуляция добровольцев *Streptococcus pneumoniae*.
- Промывание носовых ходов, проводимое через определенные интервалы времени для мониторинга носительства.
- Микробиологический анализ для подтверждения наличия инокулированных бактерий.
Основные результаты
- Успешное установление носительства пневмококка у добровольцев.
- Мониторинг выявил общие симптомы инфекции верхних дыхательных путей у некоторых добровольцев.
- После тщательного исследования ни один из симптомов не был отнесен к пневмококковой болезни.
- На протяжении всей процедуры особое внимание уделялось протоколам безопасности.
Заключение
- Данный метод представляет собой надежную модель для изучения носительства пневмококка у людей.
- Он может помочь найти ответы на важнейшие вопросы, касающиеся иммунитета к пневмококку.
- Перспективные области применения включают оценку новых вакцин, направленных на предотвращение носительства.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для отрасли
Создание экспериментального носительства пневмококка у человека обеспечивает естественную модель хозяина для оценки кандидатов в вакцины путем измерения предотвращения колонизации как суррогатного показателя защитного иммунитета. Такой подход способствует раннему снижению рисков при разработке новых пневмококковых вакцин, связывая иммунологический ответ с блокированием носительства у людей, что позволяет принимать решения о целесообразности дальнейшей разработки до проведения дорогостоящих испытаний эффективности. Данная модель позволяет получить представление о механизмах взаимодействия патогена с хозяином в носоглотке, повышая прогностическую точность трансляционных результатов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: Позволяет проверить терапевтические гипотезы, оценивая, предотвращает ли вакцино-индуцированный иммунитет колонизацию пневмококком у людей.
- Операционная ценность: Обеспечивает функциональную валидацию антигенных мишеней путем прямого измерения снижения носительства после иммунизации.
- Прогностическая ценность: Способствует приоритизации портфеля препаратов путем выявления кандидатов, демонстрирующих биологическую активность в соответствующей нише в организме человека.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает подготовку стандартизированных, воспроизводимых образцов человеческого происхождения для последующих иммунологических и микробиологических анализов.
- Практическая ценность: внедряет количественное определение носительства с помощью промывания носа и культуральных методов, что обеспечивает согласованность результатов в различных исследованиях.
- Готовность платформы: способствует стандартизации и масштабируемости анализа для оценки нескольких кандидатов в вакцины в контролируемых условиях.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: связывает доклинические результаты с их значимостью для человека путем тестирования эффектов вакцины на естественном хозяине S. pneumoniae.
- Механистическое снижение рисков: проясняет иммунологические корреляты защиты и влияние давления хозяина на динамику патогена в носоглотке.
- Обоснованное продвижение с учетом рисков: предоставляет данные для принятия решений о дальнейшем применении вакцины на основе эффективности предотвращения носительства и мониторинга безопасности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Модель EHPC вписывается в континуум открытий — от валидации мишени и идентификации ведущего соединения до доклинических исследований, предоставляя контрольную точку с учетом особенностей человеческого организма перед проведением крупномасштабных полевых испытаний.
- Фундаментальная биология: обеспечивает проверку гипотез о вакциноиндуцированном иммунитете и его влиянии на колонизацию носоглотки человека пневмококками.
- Скрининг: предоставляет готовые к анализу биологические образцы со стандартизированными протоколами инокуляции и промывания для воспроизводимого обнаружения носительства.
- Аналитика: позволяет получать количественные микробиологические показатели (CFU/mL) из промываний носа для сравнения вакцинированной и контрольной групп.
- Трансляционные исследования: связывает иммунологические данные с доклиническими моделями посредством подтверждения механизмов подавления носительства у людей.
- Корпоративное повторное использование: служит многократно используемой платформой для итеративной оценки кандидатов в вакцины для различных серотипов и составов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает прогностическую уверенность в эффективности вакцины, демонстрируя предотвращение носительства у естественного хозяина — человека.
- Операционная ценность: гарантирует воспроизводимость за счет стандартизированной подготовки инокулята, мониторинга добровольцев и отбора проб при промывании носа.
- Стратегическая ценность: улучшает процесс принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет снижения биологической неопределенности на ранних этапах оценки вакцины.
- Влияние на портфель: позволяет проводить приоритизацию кандидатов с учетом рисков на основе данных о предотвращении носительства у человека.
Особенности реализации
- Требуется опыт в управлении клиническими добровольцами, владение микробиологическими методами и соблюдение протоколов биобезопасности.
- Необходима контролируемая лабораторная инфраструктура для количественного определения бактерий, анаэробного культивирования и хранения образцов при −80°C.
- Требуется межгрупповая стандартизация между клиническим, микробиологическим и иммунологическим подразделениями для обеспечения единообразия при работе с образцами.
- Необходимо учитывать особенности адаптации методов при оценке различных пневмококковых серотипов или иммунных ответов, индуцированных вакцинацией.
- Существуют практические ограничения, включая сложность набора добровольцев, трудоемкость мониторинга симптомов и пороги чувствительности при выявлении носительства.
Часто задаваемые вопросы по биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
1:41
Inoculum Preparation and Volunteer Inoculation
3:41
Nasal Wash (NW) Procedure
4:35
Nasal Wash Processing
6:11
Results: Representative Pneumococcal Blood Agar Plate Cultures and Reported Symptoms in Pneumococcal Inoculum Recipients
7:18
Conclusion
