Мониторинг дендритных клеток с использованием миграции ¹⁹ F / ¹ H Магнитно-резонансная томография

Общая цель данного эксперимента заключается в визуализации миграции дендритных клеток в дренажный лимфатический узел с помощью неинвазивной магнитно-резонансной томографии с фтором или МРТ в сочетании с обычной протонной МРТ. Это достигается путем предварительной подготовки дендритных клеток, полученных из костного мозга мыши, и маркировки полностью дифференцированных клеток частицами, богатыми фтором. На втором этапе меченые фтором клетки вводятся внутрикожно в задние конечности мыши, обеспечивая эффективную трансмиграцию введенных клеток.

Затем анатомическая область, представляющая интерес, визуализируется с помощью фтора, протонной МРТ, чтобы контролировать миграцию дендритных клеток из кожи к дренирующим лимфатическим узлам. В конечном счете, миграция дендритных клеток из области приложения в дренирующий лимфатический узел может быть визуализирована с помощью фторсодержащей МРТ. Основное преимущество этого метода перед другими методами отслеживания клеток, такими как те, которые требуют наночастиц оксида железа, заключается в том, что углеродные полы практически отсутствуют во всех живых организмах.

Это дает полные изображения без фона и полную клеточную селективность после применения меченых фтором клеток in vivo. Этот метод может помочь ответить на вопросы в области иммунологии, например, каково влияние молекулярных кандидатов на миграцию дендритных клеток in vivo. Метод демонстрируют Юлия Ковски, техник и Хельма VIIs, старший научный сотрудник моей лаборатории. На 10-й день культивирования дендритных клеток костного мозга.

Активируйте дендритные клетки с помощью ЛПС в течение 24 часов. Пометьте дендритные клетки одним миллимолярным фтором, богатым на каждую корону фтора, пятью эфирными частицами в течение этого времени, чтобы подтвердить, что дендритные клетки были успешно мечены, проверьте физические химические характеристики клеток с помощью проточной цитометрии. Клетки, меченные фтором, показаны здесь красными событиями на прямой и боковой диаграмме рассеяния, а непомеченные клетки показаны как синие события.

Затем поместите черную мышь C 57 в держатель, а затем загрузите туберкулиновый шприц объемом 0,5 миллилитра с иглой 26 с половиной калибра с флуоресцентно мечеными дендритными клетками объемом от 50 до 100 микролитров. Теперь осторожно введите иглу в верхние слои кожи в каждой из задних конечностей животного, чтобы ввести клетки. После обезболивания мышь находится в положении лежа на мышиной кровати с помощью МР-сканера для мелких животных.

Закрепив животное на держателе для визуализации и подключении к системе мониторинга, переместите держатель к центру протонной фторсодержащей радиочастотной катушки для подтверждения правильного позиционирования животного и сканера. А в дальнейшем планирование геометрии среза изображения. Получение разведывательных изображений в трех стандартных ориентациях с помощью быстрых методов получения изображений с низким разрешением в программном обеспечении MR Scanner.

Настройте радиочастотную катушку на частоту протонного резонанса и на частоту фторсодержащего резонанса. Используйте настроечный монитор МР-сканера животных, чтобы согласовать характеристическое сопротивление катушки с точностью до 50 Ом. Далее задают необходимые автоматические настройки системы, в том числе шимминг для тонкой настройки однородности магнитного поля системы регулировки частоты для подстройки РЧ на удельную частоту ЛА МР-системы для протонов и опорного коэффициента усиления.

Чтобы настроить амплитуду РЧ, настройте турборедкий 3D-протокол для протонного сканирования, используя TR 1500 миллисекунд и TE 53 миллисекунды, матрицу 400 на 200 на 200 и редкий коэффициент 16. Настройте поле зрения с помощью изображений разведчика. Затем запустите сканирование.

Загрузите последовательность FID с одним импульсом с TR не менее 1000 миллисекунд, а затем откройте сканирование редактирования и установите ядро на фтор в методе редактирования набора инструментов. Отмените выбор автоматического опорного усиления с помощью настройки go. Начните измерение без записи данных для отображения сигнала МРТ в режиме реального времени.

Отрегулируйте базовую частоту так, чтобы спектральный пик фтора был центрирован на нулевой герцовой частоте в окне регистрации. Затем выберите, примените базовую частоту и нажмите стоп сейчас. Клонируйте турбо редкий 3D-протокол из предыдущего протонного сканирования.

Перейдите к методу редактирования и снимите флажок с автоматического опорного усиления, как показано на этапе редактирования сканирования. Установите фторсодержащее ядро, а затем измените матрицу на 1:28 на 64 на 64, а коэффициент редкости на не менее 40. Когда сканирование будет завершено, отодвиньте держатель мыши от МР-сканера и используйте меню просмотра для наложения изображений фтора на изображения протонов.

После того, как вы принесете мышь в жертву, удалите интересующий вас попальный лимфатический узел и поместите его в пятимиллиметровую ЯМР-трубку, содержащую 100 микролитров 2% PFA. Затем поместите трубку внутрь катушки для фторсодержащей спектроскопии и переместите катушку в центр магнита ISO. Настройте радиочастотную катушку на частоту фторсодержащего резонанса, а затем на настроечном мониторе МР-сканера животных сопоставьте характеристическое сопротивление катушки с точностью до 50 Ом в пределах набора инструментов шимминга.

Установите все параметры прокладки в ноль и нажмите Применить. Затем загрузите последовательность одиночных импульсов FID с TR не менее 1000 миллисекунд. Откройте редактирование сканирования и установите ядро на фтор.

Теперь, используя настройку go, запустите последовательность, настройте базовую частоту так, чтобы спектральный пик фтора находился в центре окна регистрации на нулевой герцовой частоте, и примените базовую частоту. Затем снова отрегулируйте аттенюатор импульсов, чтобы максимизировать сигнал до 90 градусов возбуждения. Когда сигнал будет максимальным, нажмите стоп.

Наконец, в методе редактирования установите средние значения от 64 до 256 в зависимости от сигнала, а затем используйте конвейер go. Начните забор через 18-21 час после внутрикожного введения. Меченые фтором дендритные клетки мигрируют в дренирующий попальный лимфатический узел.

Движение дендритных клеток по лимфатическим протокам в дренирующий публичный лимфатический узел можно оценить, наложив анатомические изображения протонов на фторсодержащие дендритные клетки. На изображениях дендритные клетки показаны в виде фторсодержащей МРТ. Сигнал выделен красным цветом, в то время как лимфатические узлы и лимфатические протоки показаны на протонном анатомическом МРТ-изображении в оттенках серого. Для количественной оценки степени миграции дендритных клеток в дренирующие лимфатические узлы лимфатические узлы извлекают лимфатические узлы и проводят МРС фтора, как показано выше, когда фторсодержащий сигнал, полученный от каждого лимфатического узла, сравнивают с фторсодержащим сигналом, полученным от различных дендритных клеток, меченных пятью эфирными частицами на 15 крон фтора, как показано на данной калибровочной кривой. Количество меченых фтором дендритных клеток, которые достигают дренирующего лимфатического узла, может быть выведено для этого репрезентативного эксперимента.

Можно подсчитать, что в 7,5 случаях по 10 до четвертой дендритные клетки, которые не были загружены антигеном, достигали левого лимфатического узла, в то время как в 3,6 раза по 10 с точностью до пятой части дендритные клетки достигали правого лимфатического узла. Несмотря на то, что эти данные могут дать представление о молекулярных механизмах миграции иммунных клеток в нормальных условиях, они также могут быть использованы на животных моделях, таких как модели аутоиммунных заболеваний. Кроме того, применение этого метода распространяется и на область терапии рака.

Любые идентифицированные молекулярные мишени могут быть использованы для манипулирования дендритными клетками для терапии опухолей.