Ускоренное диабета 1 типа у мышей Индукционная приемными Передача диабетогенные CD4 + Т-клеток

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы быстро вызвать диабет первого типа у мышей путем переноса диабетогенных Т-клеток от трансгенных мышей к мышам, у которых отсутствуют эндогенные Т и В-клетки. Начните с забора селезенки и лимфатических узлов у мышей-доноров и очистки CD четырех положительных Т-клеток. Затем пересадите очищенные донорские Т-клетки в мышей-реципиентов.

Затем наблюдайте за развитием диабета первого типа у мышей-реципиентов. В конечном счете, этот протокол может быть использован для изучения патогенеза диабета и для исследования терапевтических вмешательств по сравнению с другими методами. Основным преимуществом данной методики переноса BDC 2.5, CD четырех положительных Т-клеток в нескользящих реципиентов является быстрое и воспроизводимое развитие сахарного диабета первого типа.

Для доноров четырех положительных Т-клеток с диабетогенным диабетом используют шестинедельных преддиабетических самок BDC 2,5 мышей, которые были определены как свободные от диабета при измерении уровня глюкозы в моче. Чтобы удалить селезенку и лимфатические узлы, пропитайте мех 70% этанолом, затем разрежьте кожу, втяните кожу до тех пор, пока мышцы передних конечностей не обнажаются. Возле основания передних конечностей должны быть видны по два лимфатических узла с каждой стороны Тщательно обхватите каждый лимфоузел маленьким пинцетом и удалите его, обрезав соединительную ткань.

Затем сделайте разрез в один дюйм в брюшине с помощью маленьких ножниц. Теперь аккуратно обхватите селезенку в центре. Тщательно обрежьте соединительную ткань и прикрепленный жир.

Затем удалите селезенку, кружева, селезенку и лимфатические узлы в 10 миллилитрах DMEM на льду. Концом стерильного поршня шприца объемом 10 миллилитров аккуратно надавите на лимфоидные органы через клеточное ситечко 70 мкм. Для получения одноклеточной суспензии.

Промойте каждое ситечко одним миллилитром DMEM несколько раз, чтобы максимально восстановить клетки. Затем переложите собранные клетки в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте при давлении 400 G в течение семи минут. При комнатной температуре повторно суспендируйте клеточную гранулу в трех миллилитрах буфера CK.

Теперь выдерживайте каждую комнатную температуру в течение пяти минут. Чтобы обеспечить эритроциты, добавьте 12 миллилитров DMEM и гранулируйте клетки центрифугированием. Промойте клеточную гранулу один раз в 10 миллилитрах DMEM.

Далее мы суспендируем клетки в пяти миллилитрах буфера для окрашивания фактов и с помощью фазово-контрастного микроскопа и гемоцитометра подсчитываем количество жизнеспособных клеток. Теперь удалите примерно один раз по 10 из шести клеток на контроль окрашивания. Также окрашивают клетки мышиными моноклональными антителами для сортировки на неактивированные трансгенные CD четыре положительные Т-клетки.

Инкубируйте все эти образцы при температуре четыре градуса Цельсия в темноте в течение 30 минут. Теперь промойте ячейки с объемом окрашивания, в три раза превышающим объем буфера для факса, и повторно суспендируйте ячейки в буфере для факса в соотношении от 10 до 7 клеток на миллилитр для сортировки образца и 300 микролитров для контроля одиночного окрашивания. Затем пропустите образец клетки через пробирку с крышкой сетчатого фильтра размером 35 микрометров.

Для удаления клеточных сгустков обработайте образцы для клеточного сортировщика с обученным оператором Выделите около трех часов, включая время настройки для сортировки примерно в 1,5 раза по 10 до восьми всего трансгенных наивных CD четыре положительных Т-клеток. Вы можете ожидать примерно 2,5 умножить на 10 из шести клеток на мышь, а скорость сортировки будет примерно в два раза по 10 четвертых событий в секунду на таком инструменте, как BD Fox Aria. Соберите отсортированные клетки в три миллилитра DMEM.

Запишите абсолютное количество отсортированных ячеек и центрифугируйте их в течение семи минут. При 400 G мы суспендируем клеточные гранулы в стерильном фосфатно-солевом буфере для адоптивного переноса Т-клеток. С помощью одномиллилитрового шприца в игле 18 калибра аккуратно ресуспендируйте очищенные CD четыре положительные Т-клетки.

Загрузите одномиллилитровый шприц, затем, готовясь к инъекции, прикрепите к шприцу иглу полукалибра с 27 точками. Задержите узел мышей-реципиентов и протрите их хвост 70%-ным этанолом, чтобы продезинфицировать место инъекции. Затем введите один раз в 10-ю часть из шести очищенных CD четыре положительных Т-клеток каждой мыши в любую из боковых хвостовых вен.

Делая инъекции в хвостовую вену, убедитесь, что вы не нажимаете поршень с усилием. Если игла на самом деле находится в вене, инъекция должна быть выполнена практически без сопротивления через пять дней после переноса Т-клеток. Ежедневно наблюдайте за мышами-реципиентами скольжения на предмет развития диабета первого типа.

Измеряйте уровень глюкозы в моче с помощью реагентных полосок в соответствии с производителями и инструкцией. Обратите внимание, что мыши с двумя последовательными показаниями уровня глюкозы в моче более 250 миллиграммов на децилитр считаются диабетиками. В типичном эксперименте каждая мышь-донор BDC 2.5 дает примерно в два с половиной раза 10 из шести наивных трансгенных CD четырех положительных Т-клеток после сортировки клеток после адоптивного переноса диабетогенных CD четырех положительных Т-клеток, у мышей контролировали концентрацию глюкозы в моче.

Адоптивный перенос небольшого количества клеток от мышей-доноров BDC 2.5 вызвал диабет первого типа у всех реципиентов без скидов к 11-му дню. При правильном выполнении эта техника может быть выполнена примерно за восемь часов от забора органов до переноса Т-клеток.