Подготовка гистологических образцов для световой микроскопии
Гистология — это термин, который относится к изучению микроскопического строения тканей и клеток. Правильная гистологическая подготовка образцов для световой микроскопии имеет решающее значение для получения качественных результатов анализа тканей.
Существует 3 основных этапа, общих почти для всех гистологических процедур. Во-первых, образец фиксируют, чтобы сохранить структуру ткани и замедлить её деградацию. Затем образец погружают в материал, или среду для заливки, который обладает схожими с тканью механическими свойствами. После заливки образец подвергают секционированию, то есть нарезают на тонкие срезы с помощью прецизионного режущего инструмента, называемого микротомом. В этом видео описываются эти общие этапы и некоторые связанные с ними концепции.
Фиксация тканей является критически важным этапом, который позволяет сохранить клеточные и тканевые компоненты и поддерживать их структуру. После гибели клетки из клеточных органелл высвобождаются естественные ферменты, которые начинают расщеплять белки во всей клетке и во внеклеточном матриксе, тем самым разрушая структуру клетки. Фиксация предотвращает такую деградацию путем прямого ингибирования способности этих ферментов переваривать белки и путем того, что делает сайты расщепления ферментов неузнаваемыми.
Двумя основными механизмами фиксации являются сшивание и коагуляция. Сшивание включает образование ковалентных связей как внутри белков, так и между ними, что вызывает уплотнение ткани и, следовательно, ее устойчивость к деградации. Коагуляция вызвана дегидратацией белков с использованием спиртов или ацетона, которые деформируют третичную структуру белка так, что гидрофобные, или водоотталкивающие, области перемещаются на поверхность белка. Коагуляционная фиксация может способствовать проникновению среды для заливки, такой как парафин, в ткань.
Одним из наиболее часто используемых фиксаторов является формалин, который представляет собой формальдегид, растворенный в воде. В процессе фиксации формальдегид присоединяется к первичным аминам, таким как амины в боковых цепях аминокислот лизина и глутамина, образуя стабильную поперечную связь, называемую метиленовым мостиком. Этот процесс по своей природе медленный и может занимать до 1-2 дней.
Перед началом фиксации следует учесть несколько факторов. Во-первых, рассмотрите диффузионную способность образца. Фиксаторы диффундируют сквозь ткани на расстояние, скорость которого зависит от коэффициента диффузии фиксатора, умноженного на квадратный корень из времени. Фиксатору, которому требуется 1 hour для проникновения на 1 mm в образец, потребуется 25 hours для проникновения на 5 mm. После того как формалин достигнет центра ткани, все еще должна произойти реакция сшивания. Таким образом, для тщательной фиксации за разумное время толщина образца должна быть ограничена 4 mm.
Во-вторых, рассмотрите объем и pH фиксатора. Соотношение объема фиксатора к объему образца должно составлять не менее 40:1, чтобы реагент не истощался слишком быстро с течением времени. В то время как некоторые фиксаторы предназначены для работы при кислом pH, формалин лучше всего работает при фосфатной буферизации для поддержания нейтрального pH, чтобы не образовывался избыток кислоты, который вызывает артефакты в ткани.
Следующим этапом гистологической подготовки является заливка, которая заключается в помещении образцов в среду, обладающую механической жесткостью, схожей с жесткостью самого образца. Выбор подходящей среды для заливки имеет решающее значение, так как при избыточной жесткости или недостаточной прочности среды при микротомировании могут возникнуть дефекты. Самым распространенным средством для заливки является парафин.
Перед заливкой в парафин образцы должны быть обезвожены путем замены воды в тканях сначала этанолом, затем ксилолами и, наконец, теплым расплавленным парафином. После того как парафин инфильтрировал образец, его осторожно помещают в форму и заполняют дополнительным парафином для создания блока. Затем образцы закрепляют в гистологической кассете для последующего микротомирования.
Микротомирование — это процесс нарезания тонких срезов образца из залитого блока. Для использования в световой микроскопии толщина срезов обычно составляет 4-10 µm.
Для нарезания срезов на микротоме сначала закрепляют металлический, стеклянный или алмазный нож. Затем образец помещают в держатель. После этого образец подводят к режущей поверхности и перемещают вдоль ножа для получения среза нужной толщины. Срезы собираются в виде тонких лент, которые затем можно перенести на предметные стекла.
После микротомирования образцы помещают на стекла. В случае с образцами, залитыми в парафин, срезы сначала помещают в теплую водяную баню, после чего их поднимают из воды на предметное стекло и оставляют до высыхания.
Биологические ткани обладают очень низким собственным контрастом, поэтому после гистологической обработки срезы обычно окрашивают красителями или антителами, которые подчеркивают морфологию или специфические белки. Наиболее распространенным методом окрашивания является окраска гематоксилином и эозином, или H&E. Из-за широкого применения этого метода было создано множество автоматических приборов для воспроизводимого окрашивания большого количества срезов H&E. Гематоксилин окрашивает ядра клеток в синий цвет, а эозин — цитоплазму в розовый, что позволяет выявить клеточную морфологию тканей.
Одним из недостатков фиксации является то, что сшивание белков может затруднить поиск сайтов связывания для маркирующих антител. Вместо использования фиксации для сохранения образцов можно применять быстрое замораживание тканей, или шоковую заморозку, за которой следует метод получения срезов, называемый криосекционированием.
Образцы тканей заливают и ориентируют в специальной среде для замораживания, называемой OCT (оптимальная температура резания — optimal cutting temperature medium), после чего быстро замораживают. Как и другие среды для заливки, OCT соответствует жесткости образца.
Для получения замороженных срезов используется криомикротом или криостат; этот прибор поддерживает внутреннюю температуру -20°C, чтобы лезвие и образцы оставались охлажденными. В отличие от срезов, залитых парафином, замороженные срезы можно переносить непосредственно на положительно заряженное предметное стекло сразу после секционирования.
Другим способом избежать фиксации является заливка в агар, при которой образцы покрывают свежеприготовленным жидким агарозом. По мере охлаждения агароз фиксирует ткань на месте, а излишки агароза можно обрезать.
Вибротомы, являющиеся еще одной альтернативой микротому, оснащены вибрирующим лезвием, которое перемещается по образцу, залитому в агароз. Вибротомы используются для создания толстых срезов размером от 50-1000 µm из образцов, залитых в агароз.
Обычно образцы извлекают из агароза перед окрашиванием, а затем помещают на предметное стекло, окружая их таким веществом, как вакуумная смазка, которая предотвращает сдавливание образца покровным стеклом. Для получения изображений каждого толстого среза с высоким разрешением такие препараты лучше всего изучать с помощью конфокальной микроскопии.
Вы только что посмотрели видео JoVE по подготовке гистологических образцов для световой микроскопии.
Теперь вы должны понимать этапы подготовки образцов, которые позволяют пройти путь от фрагмента ткани до готового к окрашиванию среза. Как всегда, спасибо за просмотр!
Гистология — это изучение клеток и тканей, которое обычно проводится с помощью светового микроскопа. Подготовка гистологических образцов может существ…
Гистология — это термин, который относится к изучению микроскопического строения тканей и клеток. Правильная гистологическая подготовка образцов для световой микроскопии имеет решающее значение для получения качественных результатов анализа тканей.
Существует 3 основных этапа, общих почти для всех гистологических процедур. Во-первых, образец фиксируют, чтобы сохранить структуру ткани и замедлить её деградацию. Затем образец погружают в материал, или среду для заливки, который обладает схожими с тканью механическими свойствами. После заливки образец подвергают секционированию, то есть нарезают на тонкие срезы с помощью прецизионного режущего инструмента, называемого микротомом. В этом видео описываются эти общие этапы и некоторые связанные с ними концепции.
Фиксация тканей является критически важным этапом, который позволяет сохранить клеточные и тканевые компоненты и поддерживать их структуру. После гибели клетки из клеточных органелл высвобождаются естественные ферменты, которые начинают расщеплять белки во всей клетке и во внеклеточном матриксе, тем самым разрушая структуру клетки. Фиксация предотвращает такую деградацию путем прямого ингибирования способности этих ферментов переваривать белки и путем того, что делает сайты расщепления ферментов неузнаваемыми.
Двумя основными механизмами фиксации являются сшивание и коагуляция. Сшивание включает образование ковалентных связей как внутри белков, так и между ними, что вызывает уплотнение ткани и, следовательно, ее устойчивость к деградации. Коагуляция вызвана дегидратацией белков с использованием спиртов или ацетона, которые деформируют третичную структуру белка так, что гидрофобные, или водоотталкивающие, области перемещаются на поверхность белка. Коагуляционная фиксация может способствовать проникновению среды для заливки, такой как парафин, в ткань.
Одним из наиболее часто используемых фиксаторов является формалин, который представляет собой формальдегид, растворенный в воде. В процессе фиксации формальдегид присоединяется к первичным аминам, таким как амины в боковых цепях аминокислот лизина и глутамина, образуя стабильную поперечную связь, называемую метиленовым мостиком. Этот процесс по своей природе медленный и может занимать до 1-2 дней.
Перед началом фиксации следует учесть несколько факторов. Во-первых, рассмотрите диффузионную способность образца. Фиксаторы диффундируют сквозь ткани на расстояние, скорость которого зависит от коэффициента диффузии фиксатора, умноженного на квадратный корень из времени. Фиксатору, которому требуется 1 hour для проникновения на 1 mm в образец, потребуется 25 hours для проникновения на 5 mm. После того как формалин достигнет центра ткани, все еще должна произойти реакция сшивания. Таким образом, для тщательной фиксации за разумное время толщина образца должна быть ограничена 4 mm.
Во-вторых, рассмотрите объем и pH фиксатора. Соотношение объема фиксатора к объему образца должно составлять не менее 40:1, чтобы реагент не истощался слишком быстро с течением времени. В то время как некоторые фиксаторы предназначены для работы при кислом pH, формалин лучше всего работает при фосфатной буферизации для поддержания нейтрального pH, чтобы не образовывался избыток кислоты, который вызывает артефакты в ткани.
Следующим этапом гистологической подготовки является заливка, которая заключается в помещении образцов в среду, обладающую механической жесткостью, схожей с жесткостью самого образца. Выбор подходящей среды для заливки имеет решающее значение, так как при избыточной жесткости или недостаточной прочности среды при микротомировании могут возникнуть дефекты. Самым распространенным средством для заливки является парафин.
Перед заливкой в парафин образцы должны быть обезвожены путем замены воды в тканях сначала этанолом, затем ксилолами и, наконец, теплым расплавленным парафином. После того как парафин инфильтрировал образец, его осторожно помещают в форму и заполняют дополнительным парафином для создания блока. Затем образцы закрепляют в гистологической кассете для последующего микротомирования.
Микротомирование — это процесс нарезания тонких срезов образца из залитого блока. Для использования в световой микроскопии толщина срезов обычно составляет 4-10 µm.
Для нарезания срезов на микротоме сначала закрепляют металлический, стеклянный или алмазный нож. Затем образец помещают в держатель. После этого образец подводят к режущей поверхности и перемещают вдоль ножа для получения среза нужной толщины. Срезы собираются в виде тонких лент, которые затем можно перенести на предметные стекла.
После микротомирования образцы помещают на стекла. В случае с образцами, залитыми в парафин, срезы сначала помещают в теплую водяную баню, после чего их поднимают из воды на предметное стекло и оставляют до высыхания.
Биологические ткани обладают очень низким собственным контрастом, поэтому после гистологической обработки срезы обычно окрашивают красителями или антителами, которые подчеркивают морфологию или специфические белки. Наиболее распространенным методом окрашивания является окраска гематоксилином и эозином, или H&E. Из-за широкого применения этого метода было создано множество автоматических приборов для воспроизводимого окрашивания большого количества срезов H&E. Гематоксилин окрашивает ядра клеток в синий цвет, а эозин — цитоплазму в розовый, что позволяет выявить клеточную морфологию тканей.
Одним из недостатков фиксации является то, что сшивание белков может затруднить поиск сайтов связывания для маркирующих антител. Вместо использования фиксации для сохранения образцов можно применять быстрое замораживание тканей, или шоковую заморозку, за которой следует метод получения срезов, называемый криосекционированием.
Образцы тканей заливают и ориентируют в специальной среде для замораживания, называемой OCT (оптимальная температура резания — optimal cutting temperature medium), после чего быстро замораживают. Как и другие среды для заливки, OCT соответствует жесткости образца.
Для получения замороженных срезов используется криомикротом или криостат; этот прибор поддерживает внутреннюю температуру -20°C, чтобы лезвие и образцы оставались охлажденными. В отличие от срезов, залитых парафином, замороженные срезы можно переносить непосредственно на положительно заряженное предметное стекло сразу после секционирования.
Другим способом избежать фиксации является заливка в агар, при которой образцы покрывают свежеприготовленным жидким агарозом. По мере охлаждения агароз фиксирует ткань на месте, а излишки агароза можно обрезать.
Вибротомы, являющиеся еще одной альтернативой микротому, оснащены вибрирующим лезвием, которое перемещается по образцу, залитому в агароз. Вибротомы используются для создания толстых срезов размером от 50-1000 µm из образцов, залитых в агароз.
Обычно образцы извлекают из агароза перед окрашиванием, а затем помещают на предметное стекло, окружая их таким веществом, как вакуумная смазка, которая предотвращает сдавливание образца покровным стеклом. Для получения изображений каждого толстого среза с высоким разрешением такие препараты лучше всего изучать с помощью конфокальной микроскопии.
Вы только что посмотрели видео JoVE по подготовке гистологических образцов для световой микроскопии.
Теперь вы должны понимать этапы подготовки образцов, которые позволяют пройти путь от фрагмента ткани до готового к окрашиванию среза. Как всегда, спасибо за просмотр!
Гистология — это термин, который относится к изучению микроскопического строения тканей и клеток. Правильная гистологическая подготовка образцов для световой микроскопии имеет решающее значение для получения качественных результатов анализа тканей.
Существует 3 основных этапа, общих почти для всех гистологических процедур. Во-первых, образец фиксируют, чтобы сохранить структуру ткани и замедлить её деградацию. Затем образец погружают в материал, или среду для заливки, который обладает схожими с тканью механическими свойствами. После заливки образец подвергают секционированию, то есть нарезают на тонкие срезы с помощью прецизионного режущего инструмента, называемого микротомом. В этом видео описываются эти общие этапы и некоторые связанные с ними концепции.
Фиксация тканей является критически важным этапом, который позволяет сохранить клеточные и тканевые компоненты и поддерживать их структуру. После гибели клетки из клеточных органелл высвобождаются естественные ферменты, которые начинают расщеплять белки во всей клетке и во внеклеточном матриксе, тем самым разрушая структуру клетки. Фиксация предотвращает такую деградацию путем прямого ингибирования способности этих ферментов переваривать белки и путем того, что делает сайты расщепления ферментов неузнаваемыми.
Двумя основными механизмами фиксации являются сшивание и коагуляция. Сшивание включает образование ковалентных связей как внутри белков, так и между ними, что вызывает уплотнение ткани и, следовательно, ее устойчивость к деградации. Коагуляция вызвана дегидратацией белков с использованием спиртов или ацетона, которые деформируют третичную структуру белка так, что гидрофобные, или водоотталкивающие, области перемещаются на поверхность белка. Коагуляционная фиксация может способствовать проникновению среды для заливки, такой как парафин, в ткань.
Одним из наиболее часто используемых фиксаторов является формалин, который представляет собой формальдегид, растворенный в воде. В процессе фиксации формальдегид присоединяется к первичным аминам, таким как амины в боковых цепях аминокислот лизина и глутамина, образуя стабильную поперечную связь, называемую метиленовым мостиком. Этот процесс по своей природе медленный и может занимать до 1-2 дней.
Перед началом фиксации следует учесть несколько факторов. Во-первых, рассмотрите диффузионную способность образца. Фиксаторы диффундируют сквозь ткани на расстояние, скорость которого зависит от коэффициента диффузии фиксатора, умноженного на квадратный корень из времени. Фиксатору, которому требуется 1 hour для проникновения на 1 mm в образец, потребуется 25 hours для проникновения на 5 mm. После того как формалин достигнет центра ткани, все еще должна произойти реакция сшивания. Таким образом, для тщательной фиксации за разумное время толщина образца должна быть ограничена 4 mm.
Во-вторых, рассмотрите объем и pH фиксатора. Соотношение объема фиксатора к объему образца должно составлять не менее 40:1, чтобы реагент не истощался слишком быстро с течением времени. В то время как некоторые фиксаторы предназначены для работы при кислом pH, формалин лучше всего работает при фосфатной буферизации для поддержания нейтрального pH, чтобы не образовывался избыток кислоты, который вызывает артефакты в ткани.
Следующим этапом гистологической подготовки является заливка, которая заключается в помещении образцов в среду, обладающую механической жесткостью, схожей с жесткостью самого образца. Выбор подходящей среды для заливки имеет решающее значение, так как при избыточной жесткости или недостаточной прочности среды при микротомировании могут возникнуть дефекты. Самым распространенным средством для заливки является парафин.
Перед заливкой в парафин образцы должны быть обезвожены путем замены воды в тканях сначала этанолом, затем ксилолами и, наконец, теплым расплавленным парафином. После того как парафин инфильтрировал образец, его осторожно помещают в форму и заполняют дополнительным парафином для создания блока. Затем образцы закрепляют в гистологической кассете для последующего микротомирования.
Микротомирование — это процесс нарезания тонких срезов образца из залитого блока. Для использования в световой микроскопии толщина срезов обычно составляет 4-10 µm.
Для нарезания срезов на микротоме сначала закрепляют металлический, стеклянный или алмазный нож. Затем образец помещают в держатель. После этого образец подводят к режущей поверхности и перемещают вдоль ножа для получения среза нужной толщины. Срезы собираются в виде тонких лент, которые затем можно перенести на предметные стекла.
После микротомирования образцы помещают на стекла. В случае с образцами, залитыми в парафин, срезы сначала помещают в теплую водяную баню, после чего их поднимают из воды на предметное стекло и оставляют до высыхания.
Биологические ткани обладают очень низким собственным контрастом, поэтому после гистологической обработки срезы обычно окрашивают красителями или антителами, которые подчеркивают морфологию или специфические белки. Наиболее распространенным методом окрашивания является окраска гематоксилином и эозином, или H&E. Из-за широкого применения этого метода было создано множество автоматических приборов для воспроизводимого окрашивания большого количества срезов H&E. Гематоксилин окрашивает ядра клеток в синий цвет, а эозин — цитоплазму в розовый, что позволяет выявить клеточную морфологию тканей.
Одним из недостатков фиксации является то, что сшивание белков может затруднить поиск сайтов связывания для маркирующих антител. Вместо использования фиксации для сохранения образцов можно применять быстрое замораживание тканей, или шоковую заморозку, за которой следует метод получения срезов, называемый криосекционированием.
Образцы тканей заливают и ориентируют в специальной среде для замораживания, называемой OCT (оптимальная температура резания — optimal cutting temperature medium), после чего быстро замораживают. Как и другие среды для заливки, OCT соответствует жесткости образца.
Для получения замороженных срезов используется криомикротом или криостат; этот прибор поддерживает внутреннюю температуру -20°C, чтобы лезвие и образцы оставались охлажденными. В отличие от срезов, залитых парафином, замороженные срезы можно переносить непосредственно на положительно заряженное предметное стекло сразу после секционирования.
Другим способом избежать фиксации является заливка в агар, при которой образцы покрывают свежеприготовленным жидким агарозом. По мере охлаждения агароз фиксирует ткань на месте, а излишки агароза можно обрезать.
Вибротомы, являющиеся еще одной альтернативой микротому, оснащены вибрирующим лезвием, которое перемещается по образцу, залитому в агароз. Вибротомы используются для создания толстых срезов размером от 50-1000 µm из образцов, залитых в агароз.
Обычно образцы извлекают из агароза перед окрашиванием, а затем помещают на предметное стекло, окружая их таким веществом, как вакуумная смазка, которая предотвращает сдавливание образца покровным стеклом. Для получения изображений каждого толстого среза с высоким разрешением такие препараты лучше всего изучать с помощью конфокальной микроскопии.
Вы только что посмотрели видео JoVE по подготовке гистологических образцов для световой микроскопии.
Теперь вы должны понимать этапы подготовки образцов, которые позволяют пройти путь от фрагмента ткани до готового к окрашиванию среза. Как всегда, спасибо за просмотр!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is tissue fixation necessary in histological sample preparation?
Tissue fixation preserves cell and tissue structure by preventing degradation caused by naturally occurring enzymes released after cell death. Fixation inhibits enzyme activity and makes protein cleavage sites unrecognizable. The two main mechanisms are cross-linking, which forms covalent bonds to stiffen tissue, and coagulation, which dehydrates proteins using alcohols or acetone to deform their structure.
Q2: What are the two main mechanisms of tissue fixation?
Cross-linking involves covalent bond formation within and between proteins, causing tissue to stiffen and resist degradation. Coagulation dehydrates proteins through alcohols or acetone, deforming their tertiary structure so hydrophobic regions move to the protein surface. Coagulative fixation helps embedding media like paraffin wax penetrate tissue more effectively.
Q3: How does formalin work as a fixative in tissue preparation?
Formalin, formaldehyde dissolved in water, attaches to primary amines on amino acid side chains like lysine and glutamine, forming stable crosslinks called methylene bridges. This cross-linking process is inherently slow, requiring 1-2 days for completion. Formalin works best when buffered with phosphate to maintain neutral pH and prevent tissue artifacts.
Q4: What factors should be considered before tissue fixation begins?
Consider sample diffusivity: fixatives penetrate tissue at rates related to diffusion coefficient and time, so samples should be limited to 4 mm thickness for thorough fixation. Also consider fixative volume and pH. The fixative-to-sample ratio should be at least 40:1 to prevent reagent depletion. Formalin should be buffered with phosphate to maintain neutral pH and avoid tissue artifacts.
Q5: What is the purpose of embedding media in histological preparation?
Embedding media supports specimens with mechanical rigidity similar to the tissue itself. Paraffin wax is the most common embedding medium. Choosing appropriate embedding media is critical because media that is too stiff or too weak causes sectioning defects. Prior to paraffin embedding, samples must be dehydrated by replacing water with ethanol, then xylenes, and finally warmed paraffin wax.
Q6: How does cryosectioning differ from traditional paraffin-embedded sectioning?
Cryosectioning avoids fixation by rapidly freezing tissue in OCT (optimal cutting temperature) medium, then sectioning with a cryomicrotome maintained at -20°C. Unlike paraffin sections that require water bath treatment, frozen sections are directly lifted onto positively charged glass slides immediately after sectioning. This method preserves protein structure better for antibody labeling since cross-linking does not occur.
Q7: What are alternative embedding methods to paraffin wax?
Agar embedding covers samples with freshly prepared liquid agarose that locks tissue in place as it cools. Vibrotomes with vibrating blades cut thick sections of 50-1000 µm from agarose-embedded samples. Samples are typically removed from agarose before staining and mounted on slides with vacuum grease. Thick agarose sections are best viewed using light microscopy principle instrumentation and applications for high-resolution imaging.
Главы в этом видео
0:00
Overview
1:05
Fixation of Tissue Samples
4:19
Embedding and Sectioning
6:12
Applications
9:01
Summary