Выделение гепатоцитов человека два-ступенчатой ​​коллагеназы процедуры перфузионный

Общая цель этой процедуры заключается в выделении гепатоцитов человека с помощью двухступенчатой процедуры перфузии коллагеназы. Это достигается путем предварительного канюлирования кровеносных сосудов в кусочке печени с помощью ирригационной канюли. Далее следует перфузия и переваривание кусочка печени с помощью коллагеназы.

Третьим этапом является удаление капсулы глистена, которая высвобождает диссоциированные клетки печени. Заключительным этапом является низкоскоростное центрифугирование, которое изолирует гепатоциты. В конечном счете, гепатоциты могут быть идентифицированы с помощью фазово-контрастной микроскопии или окрашивания альбумином с использованием иммуноцитохимии, а жизнеспособность и выход гепатоцитов определяются с помощью триамного синего эксклюзионного анализа.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку этапы канюляции и пищеварения сложны для изучения. Это связано с тем, что канюляция требует некоторой тонкости, а завершение пищеварения может быть трудно определить. Для тех, кто плохо знаком с этой техникой, продемонстрирует процедуру Натали Лун, техник из моей лаборатории.

В этой демонстрации мы будем использовать кусок печени лампы вместо куска человека, настроить оборудование для перфузии печени следующим образом, установить водяную баню на соответствующую температуру, чтобы растворы достигали 37 градусов Цельсия, когда они достигают печени. Кусок. 41 градус Цельсия хорош для первого, второго и третьего растворов, а для закрытого стеклянного конденсатора раствор четыре, однако, должен быть на уровне 37 градусов Цельсия, чтобы уменьшить потерю активности коллагеназы. Незадолго до обильного включения газового регулятора для оксигенации аппарата у патологоанатома, приобретите кусочек печени, который в идеале имеет почти или полностью неповрежденную блестящую капсулу и только одно место на поверхности разреза.

Этот участок печени на воронке Бюхнера, который содержит перфорированный фильтрующий диск, система перфузии теперь должна быть загрунтована раствором один с помощью изогнутой ирригационной канюли с низкой скоростью потока с оливковыми наконечниками в более крупные кровеносные сосуды на поверхности разреза части печени. По мере того, как кровь вымывается из печени, ткань становится светлее в областях с хорошей перфузией. Количество используемых канюль варьируется для печени разного размера.

Как правило, от четырех до восьми канюль следует использовать для печени с весом от менее 20 граммов до более чем 80 граммов. Выберите калибр канюли, чтобы обеспечить плотное и надежное прилегание. Оставьте мелкие кровеносные сосуды открытыми, чтобы буфер мог отточиться из ткани.

Теперь увеличьте расход на перистальтическом насосе до 110–460 миллилитров в минуту. Это хорошая перфузия, если часть печени имеет более светлый цвет по всей используемой скорости потока. Зависит от размера печени, при этом более высокие показатели перфузии используются для более крупных печени.

Вообще говоря, средняя скорость перфузии в 44 миллилитра в минуту на канюлю является идеальной для различных масс печени. Выбранная скорость потока должна привести к небольшому увеличению объема печени. Поддерживайте кусочек печени во влажном состоянии во время перфузии, накрыв его куском марли, смоченным в физрастворе.

После перфузии ткани одним литром раствора, необходимо вымыть остатки крови в печени. Замените перфузионную жидкость на второй раствор и перфузируйте в течение 10 минут. Далее переключите перфузионную жидкость на раствор три и перфузируйте с половиной литра.

Теперь поменяйте перфузионную жидкость на четвертый раствор, который содержит коллагеназу. Проводите эту перфузию рециркуляционным способом в течение 9-12 минут или до тех пор, пока печень не будет достаточно переварена. Ткань печени должна казаться слегка разорванной под блестящей капсулой.

Печень также должна быть размягчена при прощупывании тупой стороной скальпеля. Важно переваривать печень в течение нужного количества времени, так как чрезмерное переваривание может привести к низкой жизнеспособности гепатоцитов, а недостаточное переваривание может привести к низкому выходу гепатоцитов. Начните с выключения перистальтического насоса и извлечения канюли из печени.

Затем поместите ткань в кристаллизующую чашку, содержащую от 100 до 200 миллилитров раствора. Пять. Снимите капсулу с глистенами осторожно и аккуратно вытряхните клетки. Если есть области, которые плохо перфузируются, можно использовать скальпель, чтобы разрезать эти области, чтобы высвободить содержащиеся в них клетки.

Добавляйте еще пять растворов по мере необходимости в процессе и в конечном итоге доведите объем раствора пять до 500 миллилитров. Теперь дважды отфильтруйте клеточную суспензию. Сначала отфильтруйте элементы через нейлоновую сетку толщиной 210 микрон в литровую коническую колбу.

Затем отфильтруйте элементы через нейлоновую сетку толщиной 70 микрон в литровую коническую колбу. Вылейте два равных объема клеточной суспензии в центрифужные пробирки объемом 200 миллилитров. Затем центрифугируйте отфильтрованную суспензию клеток при 72 Gs в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

Отсадите снат и аккуратно ресуспендируйте клеточную гранулу примерно в 200 миллилитрах раствора. Пять. Повторите центрифугирование и реактивную суспензию три раза после окончательного центрифугирования ресуспендируйте клетки в холодном растворе до конечной концентрации от двух до 5 миллионов гепатоцитов на миллилитр. Для точного измерения количества клеток с помощью гемоцитометра можно использовать триамовый синий анализ.

Здесь представлены окрашенные в синий цвет гепатоциты из 648 изоляций. Средняя жизнеспособность выделенных гепатоцитов человека составила 77 плюс-минус 10%Средний выход гепатоцитов составил 13 плюс-минус 11 миллионов гепатоцитов на грамм печени с помощью иммунофлюоресценции. Выделенные гепатоциты, которые положительно окрашивались на альбумин в зеленый цвет, имели чистоту 94 плюс-минус 1% для определения чистоты гепатоцитов.

Иммунофлуоресцентное окрашивание проводили четыре раза с пятью повторами в каждом испытании. Фазово-контрастная микроскопия показывает морфологические характеристики гепатоцитов, такие как их большой размер клеток и многоугольная форма. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как изолировать гепатоциты человека с помощью двухэтапной процедуры перфузии коллагеназы.