Создание В пробирке Система по изучению внутриклеточных Поведение Candida glabrata В человека ТНР-1 макрофагов

Общей целью данной процедуры является создание модельной системы in vitro для изучения внутриклеточного поведения условно-патогенного гриба человека. Canida lab ratta в макрофагах, полученных из моноцитарной клеточной линии человека TP one. Для достижения этого ТГП моноциты сначала обрабатывают четырьмя эфирами, чтобы дифференцировать их в макрофаги.

Следующие макрофаги THP one заражаются клетками canida GTA через два часа после заражения. Нефагоцитозные клетки GTA canida удаляются с помощью промывок PBS, а внутриклеточные e-клетки восстанавливаются для дальнейших исследований с помощью осмоса инфицированных макрофагов. Этот протокол может быть использован для оценки как вируса к клеткам canida GTA в макрофагах, так и созревания Faiz Ross и цитокинового ответа в THP на макро FIDS при инфекции Candida GTA.

Кроме того, этот протокол может быть масштабирован для скрининга мутантной библиотеки Candida collaborator на измененные профили выживаемости в одномерных макрофагах TSP с полувысокой пропускной способностью. Основное преимущество этого протокола заключается в том, что он относительно недорогой, легко воспроизводимый и легко адаптируется к различным иммунным клеткам, а также грибковым патогенам. Чтобы начать процедуру за два дня до инфекции, доведите ТГП и моноцитарные клетки до 80% CO в первый день, уберите культуральный риск и медленно, осторожно вводите все тонкие клетки в суспензию.

Перенесите суспензию одноклеточных моноцитов DHP в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Центрифуга Клетка суспензия при комнатной температуре в течение четырех минут При 1000 об/мин Декан Среда в контейнер для отходов при пяти мл предварительно API среда в пробирку и реус. Суспензируйте одноклеточную гранулу THV, осторожно пипетируя среду три четыре раза.

Возьмите 10 микролитров клеточной суспензии для определения плотности клеток с помощью гемоцитометра и отрегулируйте плотность клеток до 1 миллиона клеток на мл. Добавьте один микролитр одного 60 микролярного стокового раствора PMA в клеточную суспензию так, чтобы конечная концентрация составила 16 аномоляров и хорошо перемешайте. Дозируйте по одному мл клеточной суспензии, соответствующей 1 миллиону клеток, в каждую лунку 24-луночного планшета для культуры тканей и перенесите его в инкубатор, установленный при температуре 37 градусов Цельсия и 5% CO2.

После 12 часов инкубации выбросьте старый носитель. Добавьте по одному мл предварительной среды RPI в каждую лунку и инкубируйте тарелку еще 12 часов. Эти клетки будут использоваться для лечения канадской инфекции, которая будет показана позже.

Используя надлежащие микробиологические методы, инокулируйте одну колонию EA в чешуйчатую среду, содержащую ML YPD. Инкубируйте флаш в течение 14–16 часов в инкубаторе, установленном при температуре 30 градусов Цельсия после инкубации на центрифуге. Одна ML Culture при 4 000 об/мин в течение пяти минут.

Выбросьте супнатин и трижды промойте ракушки стерильным PBS. После удаления промывочного буфера суспендируйте клеточную палитру в одном мл стерильного PBS с помощью осторожного пипетирования. Затем измерьте поглощение клеточной суспензии в спектрофотометре на 600 нанометрах и отрегулируйте плотность клеток до 2 миллионов клеток на мл с помощью PBS.

Возьмите 50 микролитров клеточной суспензии и разведите в сто раз В PBS выложите в тарелку сто микролитров культуру на среду YPD AGA. Инкубируйте планшет при температуре 30 градусов Цельсия и подсчитайте количество колоний, появившихся на планшете YPD через один или два дня, умножьте это число на соответствующий коэффициент разведения, чтобы рассчитать единицы, образующие колонии в нулевой час. Эти многочисленные колониеобразующие единицы Canada Reta будут использоваться для инфицирования DHE на макрофагах.

На следующем шаге добавьте 50 мкЛ суспензии канадских клеточных клеток к монослою макрофагов в 24 китовой культуральной пластине. Испочвите пластину, чтобы равномерно распределить каждую ячейку, и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия после двухчасовой инкубации. Выбросьте среду, перевернув культуральную тарелку в контейнер к каждой лунке культуральной тарелки в мл серийного PBS осторожно вдоль стенки лунки тщательно и выбросьте буфер.

Повторите этот шаг еще дважды. Далее, кроме Первой лунки, добавьте по одной ML среды RPI во все остальные лунки, которые можно использовать для мониторинга внутриклеточной репликации кандидологических клеток через 4, 6, 12 и 24 часа после заражения, чтобы восстановить внутриклеточные Е-клетки после двухчасовой макрофагальной инфекции, добавьте одну мл зерновой воды в фос. Через две минуты осторожно соскребите лунку одним наконечником ML, чтобы удалить макрофагальный мусор из лунки.

Промойте лунку и соберите ее в макроцентрическую рыбную трубку. Приготовьте стократное разведение лизата клеток microFIT в PBS и нанесите сто микролитров на среду YPD AGA. Инкубируйте пластину при температуре 30 градусов Цельсия в течение одного-двух дней и подсчитайте количество колониеобразующих единиц.

Умножьте это число на соответствующий коэффициент разведения, чтобы перечислить количество клеток canida ator, которые фагоцитируют Т-2 и макрофаги после двухчасового заражения. Точно так же количество внутриклеточных клеток canida ator может быть определено в разные моменты времени. Постинфекционный период и внутриклеточная репликация могут быть представлены как увеличение через 24 часа по сравнению с КОЕ, интернализованными через два часа, показанными здесь.

Другие результаты типичного эксперимента, в котором общее количество клеток canida gator, инфицированных одним макрофагом, составляет шесть умножить на 10, два на четыре. Количество клеток, восстановленных за два часа, составляет 3,7, шесть умножить на 10,4. Таким образом, это иллюстрирует, что Е-клетки фагоцитируются со скоростью 62,66% в течение 24-часового периода совместной инкубации.

Может ли АЛ-клетки отличнее 5,2-кратной репликации, так как количество внутриклеточных Е-клеток увеличилось с 3,76 раза 10,4 до 1,96 раза 10,5. В этом эксперименте внутриклеточная репликация клеток canida TER также может быть оценена с помощью GFP, экспрессирующего Е-клетки, в то время как для этого используется конфокальный микроскоп. Подготовьте и заинфицируйте THV и макрофаги в четырехкамерном предметном стекле, используя протокол, описанный ранее для 24-луночного планшета для культивирования.

Через два часа после заражения. Выбросьте среду, перевернув предметное стекло в контейнер для отходов со скоростью 500 микролитров PBS на каждую камеру предметного стекла. Хорошо промойте и выбросьте PBS.

Повторите этот шаг еще два раза при 500 мкл 3,7%официальной высоты для фиксации ячеек. Выдержите предметное стекло при комнатной температуре в течение 20 минут и выбросьте формальный de Height. Промойте каждую лунку ценой 500 микролитров PBS для проникновения мобилизуйте макрофаги на 500 микролитров Triton X после пятиминутной инкубации, удалите Triton X промойте лунку ударом PBS.

Осторожно разберите задвижку камеры с помощью съемной камеры и направляющей пневматической подвески. Поместите по одной капле крепежного носителя vector Shield, содержащего DPI, на каждый сектор крепления предметного стекла, защитный лист и заклейте края краской для ногтей, визуализированных клеток под конфокальным микроскопом. Здесь показаны репрезентативные конфокальные изображения TP one макрофагов, инфицированных GFE экспрессирующими лабораторные клетки canida дикого типа, примерно шестикратное увеличение количества внутриклеточных e-клеток от двух до 24 часов свидетельствует о лабораторной репликации canida в TP один подход к мутагенезу сигнатурной метки макрофагов широко используется для идентификации факторов улентности у микробных патогенов, при этом большое количество мутантов одновременно проверяется на дефекты роста с помощью уникального олигонуклеотида тег последовательности.

Здесь мы опишем наш протокол скрининга STM Канадской библиотеки и библиотеки мутантов, который состоит из следующих трех шагов. Первые 96 плазмид. Каждый из них, содержащий уникальный стек олигонуклеотидных последовательностей, иммобилизован на нейлоновой мембране.

На втором этапе пул из 96 мутантов CANIDA ator проверяется на предмет измененных профилей выживаемости в макрофагах THV one, после чего следует восстановление YPD, выращенных и интернализованных макрофагов мутантных Е-клеток, которые будут называться входными и выходными образцами соответственно. Наконец, метки подписи ДНК представляют собой амплификацию PCI и радиометку из входных и выходных образцов геномной ДНК. Продукт ПЦР гибридизуется с уникальными метками, а радиоактивные сигналы на мембране количественно оцениваются и анализируются.

Чтобы собрать устройство из картона 96 12 точек, поместите влажную нейлоновую мембрану поверх влажной бумаги из ветряного дерева и затяните винты устройства. Промыть мембрану стерильной водой с последующим промыванием 0,4 мму гидроксида натрия. Перенесите 200 нанограмм раствора PLA BDNA из блока 96 12 в соответствующие лунки точечного кровяного приложения После промывки гидроксидом натрия 0,4 моляра.

Удаляют мембрану из точечного аппарата крови после проведения двух XXSC-скрещиваний перенесенной плазмы BDNA к мембране в УФ-сшивателе. Инкубация мембраны в антеннах для предварительной гибридизации, буфера и ввода, а также в бутылках UNE в течение двух часов при температуре 42 градуса Цельсия. Подготовьте радиоуровневые зонды методом ПЦР с использованием геномной ДНК, выделенной из входных и выходных клеточных палитр и праймеров, против инвертированной фланговой области уникальных меток.

Денатурируйте радиометку при температуре 99 градусов Цельсия в течение пяти минут и нанесите гель на лед. Перенесите зонды de во входную и выходную бутылки и инкубируйте в течение 14–16 часов при температуре 42 градуса Цельсия. После гибридизации.

Промойте входную и выходную мембраны, как описано в протоколе. Выньте мембраны из бутылок, высушите на воздухе и подвергните их воздействию экрана с фосфофоническими изображениями. Через два-три часа отсканируйте фосфорный экран и получите изображения.

В этом примере показаны два гибридизованных мембранных фильтра, которые представляют собой скрининг одного пула из 96 мутантов canida Gatory на измененную выживаемость. При количественном определении одного макрофага и определении отношения интенсивности сигнала каждого пятна на выходе к входной мембране было выявлено, что номера меток 13, 26, 75 и 85 недостаточно представлены на выходе. Эти стеки обведены красным цветом и отражают рост четырех разных мутантов.

Напротив, мутанты с уникальными последовательностями 11 и 81, выделенными зеленым цветом, чрезмерно представлены в выходной выборке. Другими словами, с этого экрана пул из 96 мутантов: два мутанта должны увеличить выживаемость, в то время как четыре мутанта проявляются при росте в макрофагах. Измененные фенотипы выживаемости, выявленные при таком скрининге пула, должны быть проверены с помощью анализов на одну инфекцию.

После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о том, как действовать и in vitro оральная система для изучения профиля роста грибкового патогена, который вас интересует. Кроме того, теперь вы сможете проводить крупномасштабный скрининг пула мутантов с помощью этой системы.