Вперед генетические подходы в Хламидиоза

Общая цель этой процедуры заключается в проведении генетического анализа chlamydia tritus путем проведения химического мутагенеза и определения ассоциаций фенотипа генотипа. Это достигается путем создания сначала мутантных штаммов chlamydia tracom с использованием химического мутагенеза. Затем все мутации, генерируемые химическими веществами, идентифицируются с помощью секвенирования всего генома, за которым следует референсная сборка генома.

Затем выявляются фенотипические ассоциации генотипов у мутантных штаммов. Наконец, фенотипические ассоциации генотипов подтверждаются путем генерации рекомбинантных штаммов и их анализа. В конечном счете, могут быть получены результаты, показывающие, что мутация в определенном гене хламидиоза приводит к фенотипу, представляющему интерес, благодаря комбинации классических подходов к химическому мутагенезу и следующему поколению Сингха.

В настоящее время не существует доступных методов замены генов у хламидий, а молекулярно-генетические инструменты для его изучения находятся в зачаточном состоянии. Этот метод не требует трансформации с помощью рекомбинантной ДНК или разработки молекулярно-генетических инструментов, но позволяет достичь той же цели. Это присвоение функции отдельным продуктам генов.

Для приготовления культивируемых клеток рассаживают примерно один раз по 10 из шести вир-клеток на 25 сантиметров в квадрате в трех миллилитрах DMEM, дополненных 10% FBS, инкубируют при 37 градусах Цельсия с 5% углекислого газа. Когда примерно через 24 часа клетки достигают конвенции, аспирируйте среду и инфицируйте клетки хламидиозом при кратности инфекции в пять раз. В общем объеме три миллилитра D-M-E-M-F-B-S, содержащего 200 нанограмм на миллилитр циклогексимида для начала мутагенеза через 18 часов после заражения под химическим колпаком, приготовьте 20 миллиграммов на миллилитр этилметана сульфоната или EMS в PBS с хлоридом кальция и хлоридом магния.

ЭМС является мощным мутагеном и канцерогеном. Поэтому обратитесь к текстовому протоколу для его утилизации. Отсадите среду из клеток Vero и промойте их один раз тремя миллилитрами PBS с хлоридом магния и хлоридом кальция.

Затем на три миллилитра раствора ЭМС и выдерживают в течение одного часа в вытяжном шкафу при комнатной температуре. После инкубации извлеките EMS и поместите его в контейнер с одним молярным гидроксидом натрия для инактивации мутагена перед трехкратной промывкой клеток, чтобы удалить любые остатки EMS. Затем при шести миллилитрах DMEM 10% FBS с 200 нанограммами на миллилитр циклохейда и 25 микрограммами на миллилитр гентамицина и инкубировать при 37 градусах Цельсия с 5% углекислым газом в течение 48-72 часов.

Включения появляются без бактерий примерно через 36 часов после мутагенеза через 72 часа. Около 10% включений заполнены бактериями, в то время как остальные остаются пустыми для извлечения элементарных тел или ЭБС путем гипотонического лизиса полностью аспирируют среду. Добавьте один миллилитр воды и качайте в течение 10 минут, чтобы выбить клетки, лизуйте клетки путем пипетирования вверх и вниз не менее 10 раз.

После сбора лизата в микропробирку добавьте 0,25 миллилитра пяти x сахарозы, фосфатного глутаматного буфера или SPG до одной x конечной концентрации и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия. Установите сливающиеся монослои клеток ves в шести луночных планшетах путем засеивания примерно 0,4 умножить на 10 из шести клеток в три миллилитра DMEM 10% FBS на лунку, чтобы клетки образовали однородный монослой в течение следующих 24 часов. Далее ложимся на лед стоковый раствор мутагена хламидиоза.

Затем приготовьте шесть пробирок десятикратного серийного разведения общим объемом 200 микролитров на одно разведение в DMEM 10% FBS, и положите их на лед. Используйте три миллилитра на лунку PBS, чтобы дважды промыть клетки Vero. Затем добавьте по три миллилитра DMEM в каждую лунку на шесть лунок и 100 микролитров бактериального разведения в двух экземплярах.

Поворачивайте пластину, чтобы обеспечить равномерность смешивания. Вращайте зараженные пластины при температуре 2 700 GS в течение 30 минут при температуре 15 градусов Цельсия. Затем инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия во влажном инкубаторе с 5% углекислым газом в течение одного-двух часов.

Тем временем приготовьте 0,54% AROS в DMEM, сначала смешав следующие ингредиенты и перемешав. Ну а затем смешайте 18,9 миллилитров горячего стерильного, 1,2% арос в воде, помешивая, чтобы не было комочков. Держите смесь в тепле на водяной бане при температуре 55 градусов Цельсия.

Отсадите бактериальную суспензию из посуды и добавьте шесть миллилитров теплого раствора для аро. Дайте ему полностью застыть при комнатной температуре снаружи вытяжки. Затем в колпаке биобезопасности со снятыми крышками высушите пластины еще 15 минут, когда пластины высохнут, инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в инкубаторе с углекислым газом в течение семи-10 дней.

Бляшки должны быть видны с помощью препарирующего микроскопа за день до выделения мутантов. Смотрите от одного умножить на 10 до четырех нулевых ячеек в 100 микролитрах на лунку. В 96-луночной пластине клетки будут сливаться в течение 24 часов.

Под микроскопом вскрытия отметьте бляшки, которые необходимо собрать, а затем с помощью стерильной барьерной пипетки объемом один миллилитр собрать пробки бляшек. Резус суспендирует бляшки в 100 микролитрах DMEM с добавлением 10% FBS 400 нанограмм на миллилитр, цикло, хайде и 50 микрограммов на миллилитр. Гентамицин для расширения мутантных штаммов накладывают суспензию на сливающиеся монослои клеток Vero.

Вращайте планшеты при температуре 2 700 GS и 15 градусах Цельсия в течение 30 минут перед инкубацией Harvest dbs, когда инфицировано более 50% клеток, что может произойти уже через 48 часов после заражения и даже через 14 дней. Такое количество инфицированных клеток позволяет хранить достаточное количество жизнеспособных бактерий для извлечения ВВ путем гипотонического лизиса инфицированных клеток. После отсасывают среду на 160 микролитров стерильной воды и выдерживают при комнатной температуре в течение 10 минут.

Используйте барьерные наконечники, чтобы разрушить клетки, пипетируя вверх и вниз несколько раз, чтобы обеспечить полный лизис. Наконец, перенесите по 160 микролитров каждого лизата в микрофуговые пробирки. Добавьте 40 микролитров пяти XSPG и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока не будете готовы к анализу и скринингу мутантов на фенотипы, представляющие интерес.

Воздействие мутагена приводит к появлению включений, которые кажутся лишенными бактерий, предположительно из-за гибели бактериальных клеток. Как правило, серовар LGVL 2 полностью уничтожает инфицированные клетки в течение 48 часов после заражения, но лечение мутагенами может продлить этот цикл до более чем 90 часов, и в наших экспериментах ожидается восстановление около 10% включений. Инфицированные клетки Vero, обработанные 20 мг на миллилитр EMS, привели к снижению на 99% восстановления инфекционного потомства по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения, как видно на этом рисунке.

Лечение мутагеном также приводило к появлению бляшек с измененной морфологией, в том числе небольших бляшек. Другие морфологии включают бляшки, которые выглядят зернистыми, комковатыми или сотовой формы, как показано здесь. Дозы EMS, используемые в этих исследованиях, могут привести к от 3 до 30 мутациям на геном KCL, что было оценено экспериментально с помощью NGS.

Несмотря на то, что градиентные очищенные ЭБС в значительной степени свободны от клеточного материала хозяина, ДНК хозяина также обнаруживается и составляет от 10 до 15% геномных препаратов. Скрининг на фенотипы, такие как нарушение репликации в клетках тканевой культуры, потеря биохимической активности или изменение морфологии бактерий, может быть проведен для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какие бактериальные факторы необходимы для образования и поддержания хламидий, патогенные факторы.