Выделение корковых микроглии с сохранившимися иммунофенотипа и функциональности из мышиных новорожденных
30 января 2014 г.
Одним из ключей к успешной расследования микроглии биологии является сохранение микроглии immunofunction экс естественных условиях в процессе выделения из ткани ЦНС. Изоляция микроглии через ротационным качанием результатов в высокочистых и immunofunctional клеточных культурах по оценке флуоресцентных изображений, иммуноцитохимии и ELISA после активации микроглии с провоспалительных стимулов липополисахарида (ЛПС) и Пэм 3 ЦСК 4 (Пэм).
Общая цель этой процедуры заключается в выделении кортикальной микроглии у мышиных новорожденных. Это достигается с помощью первых микрочастиц, рассекающих кортикальную ткань мозга у новорожденных с болезнью Мурен. Второй шаг заключается в выращивании смешанных культур глиальных клеток в течение 17-21 дня in vitro.
Затем микроглии выделяют из этих смешанных глиальных культур. Заключительным этапом является помещение микроглиальных клеток в планшеты для клеточных культур для дальнейших экспериментов. В конечном счете, с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии и Элизы было показано, что этот протокол изоляции сохраняет иммунофенотип и функциональность микроглии.
Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку SEP, участвующие в микродиссекции, трудно выполнить. Успешное выполнение этой процедуры требует как скорости, так и точности. Это означает, что слишком медленный подход приведет к снижению выхода клеток, в то время как неполное удаление мозговых оболочек приведет к загрязнению глиальной культуры и затруднит рост глии.
Начните с подготовки полной среды микроглии, которая далее будет называться MCM. Приготовьте одну колбу на каждого щенка и высиживайте их не менее одного часа. Этот шаг уравновешивания имеет важное значение для успеха.
Далее приготовьте аликвоту и охладите на льду. Все необходимые среды аликвотируют шесть миллилитров МКМ на каждого щенка и подогревают на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия перед вскрытием. Протрите горизонтальную рабочую станцию и микроскоп для препарирования 70% этанолом.
Затем поместите стерилизованные хирургические инструменты, необходимые для процедуры, в рабочую зону. Подготовьте стерильную чашку с диссекционными средами для захвата головы и другую для вскрытия. Раздайте измельченную среду в отдельную чашку для измельчения мозговой ткани.
После обезглавливания и извлечения мозга поместите только что изолированный мозг под препарирующий микроскоп, чтобы визуализировать любезности, следя за тем, чтобы спинная сторона оставалась сухой и высокой. Обезопасьте мозг, вставив кончики щипцов в место пересечения среднего мозга и коры головного мозга. Оказавшись на месте, полностью удалите спинные мозговые оболочки коры головного мозга.
Затем удалите вентральные мозговые оболочки для максимальной чистоты микроглии и ее выхода. Важно полностью удалить всю менингеальную ткань. Отделите кору головного мозга от остальной части мозга.
Обязательно удалите любые остаточные мозговые оболочки коры головного мозга, которые могут присутствовать на вентральной или медиальной стороне коры головного мозга. Удалив менингеальную ткань, поместите кортикальные средства в приготовленную ранее форму для фарша. Работая в шкафу биологической безопасности второго класса, используйте ножницы, чтобы измельчить мозговую ткань.
Переложите измельченную ткань в 15-миллиметровую коническую трубку. Промойте ножницы и форму для фарша одним миллилитром измельчителя каждая, чтобы получить максимальный выход. Соберите и распределите эти полоскания в коническую трубку объемом 15 миллилитров, содержащую измельченную салфетку.
Оставьте тканевую суспензию в покое на одну-две минуты, дав измельченной ткани осесть на дне трубки. По истечении этого времени аккуратно извлеките и выбросьте два миллилитра надосадочной жидкости, стараясь не нарушить осевшую измельченную ткань. Добавьте в измельченную салфетку три миллилитра предварительно подогретого МЦМ, а затем с усилием взбейте ткань.
После завершения триера не должно оставаться заметных твердых тканей. Добавьте еще три миллилитра MCM с помощью того же наконечника для дозатора, чтобы собрать остаточный растиранный образец с наконечника. После сбора центрифугируйте измельченную ткань, чтобы гранулировать клетки.
По завершению верните гранулированные клетки в бокс биологической безопасности. Осторожно извлеките и выбросьте надосадочную жидкость. Аккуратно ресус.
Суспензируйте клеточную гранулу двумя миллилитрами теплого МЦМ, а затем добавьте клеточную резусную суспензию в подготовленную ранее колбу. Инкубируйте клетки в течение 24 часов. Через 24 часа осторожно постучите колбой по ладони, чтобы разрушить остатки ткани.
Проверьте ячейки до и после постукивания, чтобы убедиться, что мусор полностью удален. Далее замените фильтрующий материал на свежий МЦМ и верните колбу в инкубатор. Ежедневно проверяйте клетки для контроля роста и загрязнения.
Примерно через 17-21 день микроглиальные клетки будут готовы к забору, чтобы определить, готовы ли клетки, исследовать их под инвертированным фазово-контрастным микроскопом. Микроглия готова к сбору урожая. Когда они достигают примерно 40% беглости речи, они выглядят как маленькие, яркие сферические клетки, растущие как монослой поверх других.
Чтобы изолировать, микроглию энергично постукивают колбой по лабораторному столу. Это перемешивание помогает отделить микроглию от других глиальных клеток благодаря низким адгезивным свойствам микроглии. Запечатайте крышки колб параформой и переворачивайте смешанные глиальные культуры с помощью неувлажненного ротационного шейкера с регулируемой температурой в течение пяти часов.
По истечении этого времени визуально осмотрите на предмет того, чтобы микроглия оторвалась от поверхности колбы. С помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа микроглия представляет собой яркие сферические свободно плавающие клетки. На дне колбы будет остаточный слой астроцитов и олигодендроцитов.
Затем соберите надосадочную жидкость, содержащую микроглию, в стерильную коническую центрифужную пробирку и небо. Ресус. Суспензируйте микроглиальную гранулу в теплой микроглиальной среде для роста и определите концентрацию клеток с помощью планшета гемоцитометра. Ячейки на 24-луночном планшете на пластиковой или стерильной стеклянной крышке сползают через 24 часа.
Замените фильтрующий материал на свежий теплый MGM, чтобы удалить плавающие элементы и мусор. Этот этап имеет решающее значение для выживания клеток, и для поддержания покоя микроглии клетки микроглии готовы к экспериментам сразу после этого этапа повторного кормления для оценки чистоты микроглии. Клеточные культуры, полученные из микроглии, эндогенно экспрессирующей GFP, окрашивали на макрофагальный антиген IBA one и противоокрашивали dapi.
Для визуализации ядра клетки более 95% клеток продемонстрировали колокализацию GFP IBA one и dpi. После того, как клетки были подвергнуты воздействию ЛПС, микроглия претерпела резкое морфологическое изменение от маленького бифенотипа до амебоидной формы. Иммунофитохимическое окрашивание на Р65 свидетельствует о том, что в нормальных условиях Р65 диффузно локализуется по всей цитоплазме.
В то время как после двухчасового воздействия Pam P 65 иммунореактивность резко сместилась в ядро клетки, что подтвердило, что изолированная микроглия сохранила свою биохимическую иммунофункциональность. Секрецию провоспалительного цитокина TNF альфа определяли после воздействия PAM или LPS. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как изолировать кортикальную микроглию от зеркального новорожденного для достижения наилучших результатов.
Важно соблюдать стерильную технику и тщательно удалять менингеальную ткань из рассеченной корковой области.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается процедура выделения микроглии коры головного мозга новорожденных мышей с акцентом на важности сохранения иммунофункции микроглии в процессе выделения. Метод выделения включает микродиссекцию тканей мозга, культивирование смешанных глиальных клеток и последующее выделение микроглии для проведения экспериментов.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронауки
- Клеточная биология
- Иммунология
Теоретические сведения
- Микроглия играет важную роль в центральной нервной системе (ЦНС).
- Методы выделения могут влиять на функциональную активность микроглиальных клеток.
- Сохранение иммунофункции необходимо для получения точных результатов экспериментов.
- Для оценки активации микроглии используются провоспалительные стимулы.
Цель исследования
- Разработать надежный протокол выделения микроглии из тканей новорожденных мышей.
- Обеспечить сохранение иммунофенотипа и функциональной активности выделенной микроглии.
- Создать основу для дальнейших исследований биологии микроглии.
Используемые методы
- Микродиссекция тканей коры головного мозга новорожденных мышей.
- Культивирование смешанных глиальных клеток в течение 17–21 дня in vitro.
- Изоляция микроглии из смешанных глиальных культур.
- Использование иммунофлуоресцентной микроскопии и метода ELISA для оценки функционального состояния микроглии.
Основные результаты
- Протокол выделения позволяет получить высокочистые культуры микроглии.
- После выделения микроглия сохраняет свои иммунофункциональные характеристики.
- Активация с помощью LPS и Pam 3 CSK 4 подтверждает сохранность функциональности.
- Результаты подтверждаются методами флуоресцентной визуализации и иммуноцитохимии.
Выводы
- Описанный метод выделения эффективен для получения функциональной микроглии.
- Сохранение иммунофункции имеет решающее значение для изучения биологии микроглии.
- Данный протокол может быть применен в различных экспериментальных моделях с использованием микроглии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Выделение функциональной микроглии из новорожденных мышей позволяет снизить механистические риски при валидации мишеней в нейроиммунологии за счет сохранения иммунофенотипа и реактивности на воспалительные стимулы. Данная модель ex vivo повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска за счет поддержания состояний покоя и активации, имеющих значение для патогенеза заболеваний ЦНС. Этот метод представляет собой релевантную с точки зрения патологии систему для скрининга иммуномодулирующих соединений и оценки взаимодействия с мишенью в рамках доклинических исследований.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать пути активации микроглии с помощью анализов, основанных на воздействии LPS и Pam3CSK4.
- Практическая ценность: обеспечивает получение высокочистой микроглии коры головного мозга с сохраненной функциональностью ядерной транслокации NF-κB p65 и секреции TNF-α.
- Прогностическая ценность: способствует проверке гипотез о мишенях за счет сохранения иммунофенотипической точности при переходе от состояния покоя к провоспалительному состоянию.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: Обеспечивает стандартизированную систему монослоя микроглии для скрининга соединений после 17–21 дней созревания глиальной культуры.
- Практическая ценность: Позволяет количественно определить чистоту микроглии с помощью колокализации IBA-1/GFP (>95%) и функциональных показателей, таких как высвобождение цитокинов.
- Готовность анализа: Изолированная микроглия демонстрирует морфологические и функциональные ответы на стимулы, что позволяет проводить надежное профилирование зависимости «доза — ответ».
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная ценность: Позволяет поддерживать функциональность микроглии ex vivo, обеспечивая преемственность от этапа поиска до доклинической валидации мишеней нейровоспаления.
- Снижение механистических рисков: Сохраняет биохимическую функциональность (сигналинг NF-κB, высвобождение TNF-α), критически важную для оценки модуляции путей, опосредованных мишенью.
- Релевантность заболеванию: Позволяет моделировать состояния покоящейся и активированной микроглии, что применимо при исследовании нейродегенеративных и нейровоспалительных заболеваний.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Метод изоляции вписывается в континуум разработки препаратов — от валидации мишени до идентификации соединений-лидеров, предоставляя воспроизводимую платформу микроглии для изучения механизмов действия и фенотипического скрининга в нейроиммунологии.
- Биология открытий: Обеспечивает уточнение сигнальных путей с помощью анализа транслокации NF-κB и секреции цитокинов после иммунного воздействия.
- Скрининг: Позволяет стандартизировать анализ за счет стабильного выхода, чистоты и функционального ответа микроглии после выделения с помощью роторного шейкера.
- Аналитика: Позволяет получить количественные зависимые переменные, включая уровни секреции TNF-α и ядерную локализацию p65 для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: Связывают функцию микроглии ex vivo с релевантностью in vivo за счет сохранения иммунофенотипа и кинетики активации.
- Корпоративное использование: Устанавливает воспроизводимый рабочий процесс выделения микроглии, применимый в рамках нескольких кампаний по валидации мишеней в ЦНС.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности валидации мишеней за счет сохранения иммунофенотипа микроглии и её функционального отклика на стимулы.
- Практическая ценность: Стандартизированная изоляция с помощью механического перемешивания позволяет получать воспроизводимые культуры микроглии с чистотой >95% и сохраненной функциональной целостностью.
- Стратегическая ценность: Снижение механистической неопределенности при скрининге в области нейроиммунологии за счет поддержания поведения микроглии ex vivo, соответствующего состояниям in vivo.
- Влияние на портфель разработок: Обеспечивает приоритизацию иммуномодулирующих мишеней с учетом рисков на основе подтвержденного взаимодействия с мишенью в функциональных анализах микроглии.
Особенности реализации
- Требуется опыт в препарировании тканей новорожденных мышей и методах стерильного культивирования глии.
- Для выделения и верификации микроглии необходимы ротационный шейкер с контролем температуры и инвертированный фазово-контрастный микроскоп.
- Для обеспечения выхода и чистоты микроглии необходима стандартизация процесса удаления мозговых оболочек и длительности культивирования (17–21 день) во всех рабочих группах.
- Адаптация к другим модельным системам может потребовать оптимизации времени диссоциации и свойств адгезии микроглии.
- Практическое ограничение: выход микроглии зависит от полного удаления тканей мозговых оболочек для предотвращения контаминации глиальной культуры.
