Идентификация пост-трансляционных модификаций растительных белковых комплексов

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы идентифицировать посттрансляционные модификации белков, участвующих в растительных белковых комплексах, сначала временно или стабильно экспрессировавшихся в планах меток белка, представляющего интерес. Затем извлеките все белки из ткани растения, и иммуно осаждайте интересующий белок. Затем отделите иммуноосапитированные белки на акриламидном геле, а также извлеките и расщепите белки из представляющей интерес гелевой полосы.

Теперь отправьте образцы белка на масс-спектрометрию. В конечном счете, результаты масс-спектрометрии могут обнаруживать динамические изменения в посттрансляционных модификациях, таких как фосфорилирование. В отличие от альтернативных методов, таких как инкубация киназы in vitro с субстратом, этот метод экспрессирует белки в плантации.

Таким образом, вам не нужно знать, какая киназа отвечает за фосфорилирование. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области биологии растений, такие как передача сигналов в ответ на стресс, изменения окружающей среды или распознавание патогенов. В дополнение к идентификации фосфорилирования, сайтов активированных резистентных белковых комплексов, этот метод может быть широко применен к любой посттрансляционной модификации любого растительного белкового комплекса.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что они не привыкли работать с большим количеством экстракта и выполнять больше шагов протокола за один день. Для переходной экспрессии выращивайте штаммы агробактерий тохин до стационарной фазы. Соберите агробактерии путем центрифугирования при давлении 3000 G в течение пяти минут.

Повторно суспендируйте гранулы и инфильтрационный буфер. Буфер. Теперь проникает. Четырехнедельные растения NCOA hamana с агробактериями вручную с помощью одномиллилитрового безыгольного шприца или с помощью вакуума с 0,02% поверхностно-активного вещества, через два-пять дней после инфильтрации.

Соберите инфильтрированные листья, листья, заморозьте их в жидком азоте и храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Далее измельчают 20 грамм растительной ткани и жидкий азот с помощью ступки и пестика из 80 миллилитров холодного буфера С до 20 граммов. Хорошо перемешайте и разморозьте на льду.

Теперь гомогенизируйте тремя сериями по 10 секунд каждая на полной скорости. Отфильтруйте гомогенат и центрифугируйте при давлении 30 000 G в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия. Тем временем до 100 микролитров подходящей аффинной матрицы на 500 микролитров холодного блокирующего буфера D в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и промываем три раза одним миллилитром холодного буфера D. Далее удаляем супернат экстракта листьев и пропускаем его через шприц 0,45 микрометра.

Отфильтруйте в новую пробирку на льду. Аликвотируйте сырой экстракт. Для иммуноблоттинга.

Добавьте пять XSDS буфера загрузки страниц вихря и сварите образцы до денатурации. Добавьте в каждую пробирку по 50 микролитров аффинной матрицы, взвешенной в буфере D. Инкубировать при щадящем вращении в течение двух часов при температуре четыре градуса Цельсия, центрифугировать для гранул аффинной матрицы.

Затем возьмите аликвоту несвязанного экстракта для иммуноблоттинга. Выбросьте остатки здравомыслящих веществ, оставив на дне пробирки примерно 500 микролитров. Повторно суспендируйте раствор пульпы с помощью наконечника с широким отверстием.

Слейте смешанный раствор суспензии из обеих пробирок в одну пробирку объемом 1,5 миллилитров. Трижды импульсируйте в течение пяти секунд с помощью настольной центрифуги для осаждения аффинной матрицы и удалите наднат после трех-пяти промывок одним миллилитром холодного буфера D. Удалите излишки буфера D с помощью шприца, иглой вымывает 200 мкл соответствующего элюирующего буфера при постоянном встряхивании. Стяните три ЭИТ в одну трубку.

Затем сконцентрируйте белки, используя 30 микролитров вихревой абсорбционной смолы. Подождаем пять минут и выпадем в осадок со смолой, выбросим супернат. Добавьте 50 микролитров одного буфера загрузки страницы XSDS в осажденную аффинную матрицу или вихрь абсорбционной смолы и кипятите в течение 10 минут при температуре от 80 до 100 градусов Цельсия в центрифуге с тепловым блоком.

В кипяченой аффинной матрице смолой в течение двух минут при температуре 10 000. GS аликвотируют пять микролитров суперната для иммуноблока и запускают вместе с другими фракциями на 10-сантиметровую страницу SDS. Гель для разделения и идентификации фосфорилированных белков методом масс-спектрометрии.

Загрузите оставшиеся 45 микролитров на гелевое пятно для страницы SDS. Гель для страницы SDS с коллоидным блеском камаси синего цвета. Затем задержите гель обильным промыванием и водой, желательно на ночь.

Теперь чистым скальпелем вырежьте полосу интереса из гелевого кубика, нарежьте гель кубиками по два-четыре миллиметра и перенесите образец в пробирку. Промойте кусочки геля 50% ацетонитрилом и 50 миллимолярным бикарбонатом аммония до пятен. Затем отпижьте раствор пипеткой.

Соблюдайте осторожность, чтобы не удалить кусочки геля. Обезвожьте образец 100% ацетонитрилом в течение пяти минут и удалите свободную жидкость. Затем, чтобы уменьшить содержание дисульфидных связей белка при 10 миллимолярных DTT и инкубировать в течение 30-45 минут при 56 градусах Цельсия с встряхиванием, удалите свободную жидкость для алкилатирования остатков цистеина.

Добавьте 55 миллимоляров хлорацетамида на 20-30 минут при комнатной температуре в темноте. Удалите свободную жидкость, затем дважды промойте кусочки геля 50% нитрилом ацето в течение 10 минут. Удалите свободную жидкость.

Теперь обезвожьте кусочки геля со 100% ацетонитрилом в течение пяти минут и удалите свободную жидкость для Триптих Дижест. При 40 микролитрах рабочего раствора трипсина дайте кусочкам геля регидратироваться в течение 10 минут при достаточном буфере для разложения, чтобы покрыть кусочки геля. Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи, чтобы остановить пищеварение, и извлекайте пептиды из кусочков геля в дозе 5% ультразвука муравьиной кислоты в течение 5-10 минут.

Затем перенесите супернат в новую пробирку, высушите пептиды с помощью лиофилизации или вакуумного концентратора и храните образцы при температуре минус 20 градусов Цельсия. В этом эксперименте очищают киназный комплекс P-R-F-P-T-O из Nacoa hamana, трансгенную NACOA hamana, экспрессирующую 35 SPTO, временно трансформировали с 35 SPRF flag, а иммуноципитацию комплекса проводили с помощью Anti-Flag M two aros. Иммуноблоттинг иллюстрирует эффективную иммунопреципитацию целевого белка PRF, как PTO, так и взаимодействующего эффекторного белка, очищенного с помощью PRF, как показано при обнаружении антител и масс-спектрометрическом анализе.

В данном случае стратегия заключалась в том, чтобы нацелиться на белок PTO с помощью Anti-Flag. Стратегия была изменена. Для того, чтобы определить участки фосфорилирования ВОМ.

Общее количество белка PTO, содержащее как комплекс PRF, так и свободную форму, было иммуноосаждировано с помощью Anti-Flag M two aros и подвергнуто фракционированию страницы SDS, расщеплению триптиха ингеля и масс-спектрометрическому анализу, в результате чего пептиды PTO охватывают примерно 80% его последовательности. Интересно, что был идентифицирован набор одиночных сайтов фосфорилирования для пептидов PTO. Следует отметить, что сайты двойного фосфорилирования были идентифицированы только в присутствии любого из эффекторных белков.

Важно получить достаточное количество растительного белка для того, чтобы идентифицировать компоненты белкового комплекса, а также обнаружить посттрансляционную модификацию интересующего белка. Помните, что для картирования модификаций, таких как фосфорилирование, требуется разумное количество белка из масс-спектрометрии, поэтому, по крайней мере, слабая полоса должна быть заметна на вашем геле после этой процедуры. Другие методы, такие как I, идентификация сложных компонентов могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как активация иммунного комплекса приводит к функциональному иммунитету.

Не забывайте, что работа с органическими буферами, бактериями и бритвенными BBL может быть чрезвычайно опасной, поэтому примите меры предосторожности, такие как ношение перчаток и халатов.