Переходные экспрессии генов в табак с помощью Gibson Ассамблею и генной пушки

Общей целью данного эксперимента является наблюдение за транзиторной экспрессией генов меченного A GFP репортера в эпидермальных клетках табачных листьев. Это достигается путем разработки конструкции ДНК, которая будет экспрессироваться в хлоропластах и пероксисомах. Затем конструкция строится с использованием амплификации ПЦР и сборки Гибсона.

Затем с помощью генной пушки доставляется конструкт к эпидермальным клеткам табачного листа. В конечном счете, визуализация табачного листа с помощью конфокальной микроскопии выявляет экспрессию GFP в хлоропласте и пероксисоме. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как классическое клонирование, заключается в том, что она не требует ферментов рестрикции, и, таким образом, любая последовательность, которая может быть амплифицирована с помощью ПЦР, может быть клонирована.

Из-за гибкости генетического дизайна применение этих методов распространяется на более широкие масштабы. Генная инженерия сельскохозяйственных растений Начните этот протокол с определения участков внутри растительной клетки для окончательной экспрессии белка. Цель данной работы состоит в том, чтобы нацелить экспрессию на хлоропласты, пероксисому и цитозоль.

Затем разработайте конструкцию выражения. Конструкция должна содержать промотор, обнаруживаемый ген и терминатор в пределах одной плазмиды. В этом случае конститутивный промотор P на конце чашки два управляет экспрессией GFP, за которой следует Nolene Synthe, терминатор или nos t.

Обратите внимание, что в этом эксперименте мы будем тестировать серию меток, трит-меток, один, два и три концевых терминала к GFP на экспрессию в хлоропластах и пероксисомах. Метод сборки Гибсона основан на действии нескольких ферментов в заранее приготовленной смеси для частичного переваривания концов двухцепочечной ДНК и облегчения отжига комплементарных пар оснований соседних последовательностей ДНК. Окончательная конструкция состоит из трех частей, которые должны быть амплифицированы в четырех реакциях ПЦР перед сборкой Gibson.

Первая и вторая реакции усиливают плазмидный вектор из 8 000 пар оснований, PORE, который содержит GFP NOS T, и маркер резистентности к канусу. Маркер резистентности является хорошим местом для разделения этой большой ДНК на две меньшие матрицы, которые легче амплифицируются методом ПЦР. Третья реакция усиливает промотор P на конце чашки два, а четвертая реакция усиливает триага 1 с использованием программного обеспечения для проектирования in silico, такого как ape design, конструкт основания для основания, так что между каждой частью существует перекрытие 50 пар оснований.

При заказе праймеров для ПЦР можно использовать перекрытие 50 пар оснований, так как праймеры 25 пар оснований в каждом направлении После выполнения ПЦР для амплификации каждого компонента очистите продукт ПЦР отдельно и разведите их в дистиллированной деионизированной воде. Если ПЦР-матрица представляла собой мини-препарат от лечения кишечной палочкой рестриктазирующим ферментом DPN, то загрязняющая матрицу будет удалена ДНК. Затем измерьте концентрацию каждого из кусочков ДНК.

Отрегулируйте концентрацию вектора примерно до 150 нанограмм на микролитр для каждой собираемой конструкции, включая контрольную, достаньте из морозильной камеры аликвоту 15 микролитров смеси Gibson Assembly и разморозьте ее на льду. Использование онлайн-tool@gibbon с открытым исходным кодом. org, определить объемы для эквимолярных количеств каждого из фрагментов.

Прибавьте рассчитанный объем каждого из фрагментов к 15 микролитровой смеси Гибсона. Также подготавливают контроль только векторной ДНК. Общий объем каждой реакции должен составлять 20 микролитров.

При необходимости используйте воду для регулировки громкости. Инкубируйте пробирки при температуре от 50 до 55 градусов Цельсия в течение 30-60 минут. После инкубации поместите трубки обратно на лед.

Достаньте микропробирку, содержащую коммерческий препарат из 200 микролитров хлорида кальция и кишечной палочки, из морозильной камеры при температуре минус 80 градусов Цельсия и слегка подогрейте ее вручную. Затем добавьте все 20 микролитров реакции к кишечной палочке. Инкубируйте культуры на льду в течение 30 минут, затем перенесите их на водяную баню при температуре 42 градуса Цельсия и испытайте тепловой шок в течение 60 секунд.

Не используйте электрокомпетентные ячейки. Относительно высокая концентрация соли и низкая концентрация ДНК могут привести к образованию дуги клеток после трансформации. Верните культуры в ICE на две минуты, затем нанесите 750 микролитров среды SOC или LB и дайте им восстановиться в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия.

Следующую тарелку, смесь на планшетах LB с канучем или другим подходящим антибиотиком инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи, отсеивать 10 колоний методом секвенирования. Обратите внимание, что этот метод может привести к более высокому фону и большему количеству нецелевых рекомбинационных событий, чем традиционное клонирование на основе лигирования. Биотическая трансфекция табака с помощью генной пушки ранее была описана в JoVE.

Здесь рассматриваются ключевые шаги и отличия от предыдущих протоколов. После амплификации и изоляции конструкций подготовьте пули с генным пистолетом, как описано в статье JoVE от woods и zeto, и загрузите их в генную пушку для трансфекции эпидермальной ткани листьев табака Nico Tania Benham Miana. Выбирайте большой лист близко к основанию трех-пятимесячного растения.

Аккуратно положите его нижней стороной вверх на влажные бумажные полотенца в 15-сантиметровую чашку Петри, надев соответствующие средства защиты глаз и ушей. Установите давление гелия для генной пушки на 200-250 PS. Я осторожно направляю генную пушку между ребрами на нижней стороне листа, примерно в трех-пяти сантиметрах над ним. Отпустите предохранитель и доставьте частицы к листу.

Используйте каждую пулю дважды в одном и том же месте на листе. Переместитесь в другое место и повторите процесс, если лист взорвется, выбросьте и начните новый лист. Существуют некоторые различия в вязкости листьев из-за условий роста, таких как возраст, влажность и так далее.

После того, как все снимки будут сделаны, накройте лист и храните его два-три дня при слабом освещении на скамейке. Рассмотрите лист в препарирующем микроскопе, оснащенном УФ-флуоресценцией, и найдите отдельные клетки, экспрессирующие GFP. Когда обнаружены клетки, экспрессирующие GFP, используйте ножницы-препаранты, чтобы осторожно извлечь 5-10-миллиметровые участки листа.

Немедленно погрузите каждый отдельный фрагмент листа в лунку глубокого предметного стекла микроскопа, содержащего около 200 микролитров 0,1% Тритона Х 100. Моющее средство помогает предотвратить образование пузырьков воздуха на поверхности, а предметное стекло глубоколуночного микроскопа позволяет визуализировать клетки с большей площадью ткани с помощью конфокального микроскопа, оснащенного соответствующими фильтрами и объективом для погружения в воду с 40-кратным увеличением. В этом исследовании три различные конструкции нацеливания на органеллы GFP сравнивались с GFP без тега и рубисом. Coag.

Конфокальная микроскопия GFP использовалась для обнаружения флуоресценции GFP в транзиторно трансформированных одиночных клетках в контрольных экспериментах, в которых экспрессировался немеченный GFP. Флуоресценция наблюдается только в ядре и цитозоле, но не в хлоропластах, которые идентифицируются красной автофлуоресценцией хлорофилла, как видно в этом примере клетки, трансфицированной только хлоропластом Rubis Oag. Конструкция GFP GFP выражалась в больших органеллах.

Клетка обведена белым цветом. Желтым выделены участки колокализации конструкции с хлорофиллом, указывающие на то, что конструкция нацелена на хлоропласт, как показано на этом изображении триага: экспрессия GFP одной трансфицированной клетки наблюдается в хлоропластах, перифериях, цитозоле и небольших точечных органеллах, которые, как полагают, являются пероксисомами. Аналогичным образом, триаговые две трансфицированные клетки также экспрессируют GFP в триаге триозоля хлоропластов и пероксисоме три, которая состоит из сигнала пероксисомы, встроенного в область последовательности хлоропластов низкой сложности, локализованную только в хлоропласте и пероксисоме.

Обратите внимание, что эта ячейка находится в другом слое листа. На этом рисунке обобщена экспрессия, наблюдаемая в отсеках типичной эпидермальной клетки табачного листа. Показаны относительные размеры и расположение внутри клетки, а также уровни относительной экспрессии, наблюдаемые с помощью трансфекции генной пушки и конфокальной микроскопии.

Обратите внимание, что untag GFP локализуется на цитозоле и ядре, контроль PIMT two GFP локализуется на хлоропласте и триага один GFP, триага два GFP, а Triag 3G FP локализован на хлоропласт и пероксисому, как и прогнозировано, после просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как построить плазму с помощью сборки Gibson, Доставьте его в виде табачных листьев и наблюдайте за сцеживанием GFP в течение трех дней. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости использовать 150 нанограмм на микролитр векторной ДНК для сборки Gibson и 1500 нанограмм на микролитр окончательной конструкции ДНК для создания пуль генного пистолета.