Протокол для анализа вируса гепатита С репликации

Общая цель данной процедуры — исследование различных стадий цикла репликации вируса гепатита C. Сначала создаются транскрипты геномной РНК HCV на основе линеаризованных плазмидных конструкций HCV. На втором этапе выполняется трансфекция клеток H-C-V-R-N-A. Затем клетки высевают для анализа в различные временные точки. Заключительным этапом является сбор супернатанта клеточной культуры для измерения вирусного титра и сбор трансфицированных клеток для анализа белков и РНК. В итоге проводятся обратная транскрипция с ПЦР, вестерн-блоттинг, иммунофлуоресцентный анализ и определение титра HCV, что позволяет продемонстрировать создание надежной системы инфекционной клеточной культуры HCV.

Основным преимуществом данной системы клеточных культур, инфицированных вирусом гепатита С, по сравнению с системой репликонов HCV, является возможность исследования этапов проникновения вируса в клетку, сборки вирионов и их выхода. Данный протокол может помочь ответить на ключевые вопросы в области вирусологии гепатита С, такие как морфогенез вирионов и взаимодействие патогена с организмом хозяина. Значение этого метода распространяется на разработку вакцин, поскольку он позволяет характеризовать аттенуированные штаммы вируса, которые могут быть оценены как потенциальные кандидаты для создания вакцин.

Хотя данный метод позволяет получить представление о вирусе гепатита C, его также можно применять к другим РНК-содержащим вирусам семейства Flaviviridae. Как правило, специалисты, впервые использующие этот метод, сталкиваются с проблемой получения высококачественной геномной РНК HCV. Изучение полного цикла репликации HCV в клеточных культурах стало возможным после обнаружения изолята вируса гепатита C генотипа 2A, вызвавшего молниеносный гепатит в Японии. Визуальная демонстрация вирусологического анализа имеет решающее значение, поскольку проведение этого анализа требует экспертных знаний как в области молекулярных, так и в области клеточных методов.

Для оценки вирусной репликации с использованием внутригенотипного химерного вируса 2A F-N-X-H-C-V и pol-null HCV F-N-X-H-C-V линеаризуйте ранее созданные вирусные плазмиды путем рестрикции ферментом XBA-one в пробирке объемом два миллилитра. Затем обработайте плазмиды нуклеазой из маша для создания тупых концов.

Очистите переваренные плазмиды с помощью анионообменной хроматографии. Проверьте целостность линеаризованной плазмиды, подвергнув ДНК электрофорезу в агарозном геле. Затем добавьте матрицу в виде линеаризованной плазмидной ДНК в пробирку объемом 0,2 мл, содержащую компоненты для реакции с T-seven РНК-полимеразой, чтобы синтезировать транскрипты геномной РНК HCV.

Очистите синтезированную РНК, обработанную DNase, с помощью набора для очистки РНК. Затем подтвердите выход РНК методом электрофореза в агарозном геле. После этого определите количество РНК с помощью спектрофотометрии.

Отделите адгезивные клетки линии Huh-7 с помощью обработки трипсином и соберите их в коническую пробирку объемом 50 мл. После двух последовательных центрифугирований ресуспендируйте осадок клеток в охлажденной среде с низким содержанием сыворотки. После повторного центрифугирования ресуспендируйте клетки в среде с низким содержанием сыворотки до концентрации 1 × 10⁷ клеток/мл.

Затем смешайте в общей сложности 10 µg транскрибированной вирусной РНК с 400 µL ресуспендированных клеток в предварительно охлажденной электропорационной кювете объемом 0.4 cm. Введите вирусную РНК в клетки с помощью электропорации при 270 В, 100 Ом и 950 µF. По завершении ресуспендируйте электропорированные клетки в 10 mL полной ростовой среды с 15% FBS. После этого высейте клетки в колбы T 25 из расчета примерно 1.2 × 10⁶ клеток на колбу и в 48-луночные планшеты из расчета 1 × 10⁴ клеток на лунку для временных точек 4, 48 и 96 часов. Через 4–8 часов после трансфекции замените среду на свежую дополненную ростовую среду с 10% FBS, чтобы удалить остатки погибших клеток из культурных колб и планшетов.

С помощью серологической пипетки соберите супернатанты клеточных культур в конические пробирки объемом 15 мл в моменты времени 48 и 96 часов. Затем удалите клеточный дебрис из собранных образцов путем центрифугирования при 15 000 об/мин в течение 10 минут при температуре 4 °C. После центрифугирования храните супернатанты, не содержащие клеток, при температуре -80 °C.

Лизируйте клетки для анализа белков и РНК с помощью вестерн-блоттинга и количественной ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР) в указанные моменты времени. Проведите обратную транскрипцию 1 µg суммарной клеточной РНК с использованием фермента обратной транскриптазы и специфического праймера к смысловой цепи HCV, который связывается с 5'-нетранслируемой областью, в пробирке объемом 0,2 мл. Также проведите обратную транскрипцию F-N-X-H-C-V-R-N-A с известным числом копий генома, используя праймер к смысловой цепи HCV. С помощью системы ПЦР в реальном времени проведите кПЦР, используя 50 ng полученной кДНК, специфические праймеры к HCV и супермикс для кПЦР, содержащий зеленый краситель, связывающийся с ДНК. Для определения числа копий H-C-V-R-N-A при проведении кПЦР используйте следующие условия. После кПЦР разделите с помощью SDS-PAGE клеточный лизат образцов, трансфецированных вирусной РНК, через 96 часов после трансфекции. Затем перенесите разделенные в геле белки на поливинилиденфторидную мембрану методом trans-blot turbo. Блокируйте мембрану, используя блокирующий раствор, содержащий 5% обезжиренного молока и 0,2% tween-20 в PBS, поместив ее в контейнер.

Инкубируйте мембрану с первичными моноклональными антителами мыши к NS3 в разведении 1:1000 и к бета-актину в разведении 1:5000 в холодильной камере при температуре 4 °C. После инкубации добавьте козьи антитела к иммуноглобулину G мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, в разведении 1:5000, и проведите детектирование методом хемилюминесценции.

На данном этапе зафиксируйте трансфицированные H-C-V-R-N-A клетки метанолом в течение 30 минут при -20 °C для проведения иммунофлуоресцентного анализа. По завершении трижды промойте клетки PBS. После блокировки буфером для иммунофлуоресцентного анализа используйте кроличьи поликлональные первичные антитела anti-NS5A и мышиные моноклональные антитела anti-DSRNA J2 в разведении 1:200 и инкубируйте от пяти часов до ночи в холодильной камере при 4 °C. После инкубации с первичными антителами трижды промойте клетки PBS. Затем добавьте козьи поликлональные вторичные антитела anti-rabbit immunoglobulin-G 488 и козьи поликлональные вторичные антитела anti-mouse immunoglobulin 594 в разведении 1:1000 и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре на настольном ротаторе. После троекратного промывания клеток PBS окрасьте ядра красителем Hoechst и изучите препарат с помощью флуоресцентного микроскопа.

Затем высейте наивные клетки Huh7.5.1 в 96-луночный планшет с плотностью примерно 3×10³ клеток на лунку. На следующий день выполните десятикратное серийное разведение бесклеточного супернатанта культуры, полученного от клеток, трансфицированных H CSV RNA, используя ростовую среду, и инокулируйте его в трех повторностях на клетки Huh7.5.1. Зафиксируйте клетки через 72 часа после инфицирования, используя метанол в течение 30 минут при -20 °C. После извлечения клеток из морозильной камеры проведите иммуноокрашивание на белок H CSV NS5A в соответствии с ранее описанными условиями. С помощью флуоресцентного микроскопа подсчитайте количество очагов NS5A-положительных клеток в лунке с наибольшим разведением вируса и вычислите среднее число фокус-формирующих единиц на миллилитр.

Качество линеаризованной плазмиды HCV оценивали с помощью гель-электрофореза. H-C-V-D-N-A подвергали транскрипции in vitro с помощью Т-семи РНК-полимеразы, в результате чего был получен единичный продукт РНК размером 9,6 Kilobases. Результаты RT-qPCR показали, что вирус дикого типа эффективно реплицирует геном. У дикого типа уровень репликации генома был на один-три логарифма выше по сравнению с вирусом с делецией полимеразы (pol-null).

Вирус дикого типа вырабатывал белок NS3, участвующий в расщеплении вирусных белков и репликации генома. Вирус дикого типа также экспрессировал белок NS5A; при этом белок NS5A и двухцепочечная РНК колокализовались в цитоплазме клеток, трансфицированных вирусом дикого типа, что указывает на активную репликацию вируса. Измерения титра вируса показали, что вирус дикого типа является инфекционным и производит более 10 000 фокус-образующих единиц на миллилитр инфекционных частиц. Через шесть часов после трансфекции как вирус дикого типа, так и pol-null вирус обладали схожей люциферазной активностью, что свидетельствует о трансляции одинакового количества введенной трансфицированной РНК. Однако через 48 и 96 часов после трансфекции вирус дикого типа демонстрировал более высокие уровни репликации генома по сравнению с pol-null вирусом. Вирус дикого типа также вырабатывал вирусный белок NS3. pol-null вирус имел базовый уровень люциферазной активности, тогда как у вируса дикого типа уровень репликации был на два-три порядка выше, чем у репортерного pol-null вируса. При должном владении техникой вирологические анализы на вирус гепатита С могут быть выполнены за две недели при условии правильного проведения процедуры. При выполнении данной процедуры важно использовать жизнеспособные клетки и высококачественные транскрипты геномной РНК HCV. После завершения данной процедуры охарактеризованные штаммы HCV могут быть протестированы в моделях на животных для исследования жизнеспособности in vivo и взаимодействий между патогеном и хозяином.

Разработка системы культивирования инфекционного ВГС в клетках открыла исследователям возможность изучить этапы морфогенеза вирионов и выхода вируса из клетки в цикле репликации ВГС. После просмотра этого видео вы должны будете четко понимать, как проводить различные вирусологические анализы для характеристики разных стадий цикла репликации вируса гепатита С. Не забывайте, что работа с вирусом гепатита С может быть крайне опасной, поэтому при выполнении данной процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как использование соответствующих средств индивидуальной защиты.