Использование α-бунгаротоксина сайт связывания тегов по изучению ГАМК рецептора мембраны локализации и торговли

Общая цель этой процедуры заключается в измерении локализации поверхности ГАМК-рецепторов и эндоцитоза в нейронах гиппокампа. Это достигается путем предварительного пересечения нейронов гиппокампа с меченой субъединицей рецептора ГАМК и предоставления культивируемым нейронам возможности развиваться в инкубаторе. Второй шаг заключается в маркировке поверхностных габк-рецепторов с помощью альфа-бунгало с флуоресцентным флуоресцентным кристаллом Alexa.

Затем нейроны инкубируются в течение различных временных точек, чтобы позволить меченым рецепторам быть эндоцитозой. Последним шагом является фиксация образцов в соответствующие временные точки и выполнение иммуноокрашивания с использованием анти-GFP для наблюдения за общим пулом помеченных рецепторов. В конечном счете, конфокальная микроскопия используется для выявления изменений в локализации поверхности и эндоцитоза меченых рецепторов ГАМК с использованием фиксированных или живых методов визуализации.

Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы в области трафика рецепторов, например, какое влияние связывание лигандов может оказывать на эндоцитоз рецепторов и скорость их введения, а также могут ли различные лиганды и модуляторы влиять на рециркуляцию и деградацию рецепторов. Хотя этот метод был использован для изучения лигированных ионных каналов и рецепторов, сопряженных с G-белком, в первую очередь в контексте нервной системы, он также может быть применен для изучения динамической локализации и транспортировки других мембранных белков в клеточной культуре и первичных клетках различных тканей. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности по двум причинам.

Во-первых, для создания функциональных конструктов, а во-вторых, для обработки нескольких временных точек одновременно. Для начала приготовьте четыре-пять круглых стеклянных крышек с покрытием из полидем-лизина внутри каждой чашки для культуры тканей размером 3,5 см, как описано в текстовом протоколе. Затем трансфектируйте только что диссоциированные нейроны в день культивирования одним-четырьмя микрограммами подготовленной макси конструкционной ДНК-пластины.

Трансфицированные нейроны на покрытой поли-де-лицином оболочке скользят с конечной плотностью примерно 200 000 нейронов на 3,5-сантиметровую чашку. Замените среду через четыре-24 часа после подготовки нейрональных культур. Затем дайте нейронам развиться в инкубаторе до 14-17 дней in vitro или желаемой стадии для проведения анализа эндоцитоза.

Сначала установите настольное охлаждающее нагревательное устройство на 16 градусов Цельсия. Охладите внеклеточные кучи, буферизуя физиологический раствор или HBS до 16 градусов Цельсия на водяной бане. Переложите нейронные чашки на алюминиевую пластину при температуре 16 градусов Цельсия и остудите в течение пяти минут.

Удалите среду и замените на один миллилитр 16 градусов Цельсия HBS плюс 150 микромоляров два Bo Rine на две минуты. Затем уберите среду в контейнер с маркировкой и замените его одним миллилитром 16 градусов Цельсия HBS плюс два бокерина плюс альфа-токсин бунгало. Alexa 5 9 4 инкубируется при 16 градусах Цельсия в течение 15 минут.

После инкубации переложите среду в контейнер для отходов с маркировкой и трижды вымойте посуду двумя миллилитрами 16 градусов Цельсия HBS для экспериментов с временными рядами изображений в реальном времени после эндоцитоза рецепторов с использованием чашки для культивирования со стеклянным дном 3,5 сантиметра. Перенесите чашку на нагретый стол на микроскопе и начните визуализацию с помощью конфокального или газонного микроскопа. Настройка на фиксированные слипы крышки.

Перенос Т равен нулевой временной точке накрытие проскальзывает в чашку комнатной температуры 4% параформальдегида, 4% сахарозы на 20 минут для других временных точек. Замените HBS кондиционированной уравновешенной средой при температуре 37 градусов Цельсия и вернитесь в инкубатор для эндоцитоза при температуре 37 градусов Цельсия в необходимые моменты времени. Достаньте посуду из инкубатора и быстро вымойте два раза с двумя миллилитрами комнатной температуры, делкос фосфатом, буферным физиологическим раствором или DPBS.

Затем зафиксируйте образец в 4%-ном параформном альдегиде, 4%сахарозе на 20 минут. После 20-минутной фиксации удалите 4%-ный параформный альдегид, 4%-ную сахарозу в контейнер для отходов, и дважды вымойте посуду двумя миллилитрами DPBS комнатной температуры. Далее выдержите крышку слипа при комнатной температуре в течение 10 минут.

Раствор иммунофлуоресцентного блока, содержащий 0,2% тритона X 100 для проникновения в нейроны и обеспечения иммуноокрашивания внутриклеточного рецептора против GFP и/или мечения других белков, представляющих интерес. Затем удалите проницаемый блочный раствор и инкубируйте покровные стекла в растворе иммунофлуоресцентного блока без Тритона Х 100 в течение 20-30 минут. Проводите первичную инкубацию антител в блоке в течение нескольких часов при комнатной температуре или в течение ночи при четырех градусах Цельсия после инкубации.

Промойте чехлы, замочив их в DPBS на пять минут, всего три стирки. Затем инкубируют покровные листы со вторичными антителами в блочном растворе в течение одного часа при комнатной температуре через час. Как и раньше, трижды промойте чехлы с помощью DPBS.

Затем закрепите каждое защитное стекло, удалив лишнюю жидкость с обратной стороны защитного стекла с помощью лабораторной салфетки, а затем переверните защитное стекло на четыре микролитра монтажного материала на предметном стекле. Получение изображений с помощью конфокальной микроскопии слепо к экспериментальным условиям с использованием числовой апертуры с 60-кратным увеличением масла. 1.49 Цель погружения.

Используя одни и те же настройки получения изображений, получить изображения одного Z-сечения с телом нейронной клетки и несколькими дендритными процессами в фокусе, количественно определить альфа-бунгалотоксин, флуоресцентный сигнал Alexa и иммуноокрашивание GFP вдоль 20 микрон трех-четырех проксимальных дендритов на нейрон, используя один и тот же порог для анализа всех данных эндоцитоза. Анализируйте данные от 10 до 12 нейронов для каждой временной точки. Повторение эксперимента с несколькими независимыми культурами нейронов.

ГАМКергические аксоны вступают в тормозящие контакты с дендритами пирамидальных нейронов. Пресинаптические тормозные терминали идентифицируются везикулярным тормозящим транспортером аминокислот, который загружает ГАМК и глицин в синаптические везикулы. Рецепторы ГАМК тесно противоположны сайтам высвобождения нейротрансмиттеров, связанным постсинаптическим тормозящим каркасом Показанный здесь белок Protein gein представляют собой альфа-два нейрона, экспрессирующие phg F-P-B-B-S с поверхностными рецепторами ГАМК, помеченными токсином Alexa 5 9 4 бунгало с последующим иммуноокрашиванием для общей популяции рецепторов антителами против GFP, показанными зеленым цветом, и либо постсинаптическим ингибиторным скаффолдным белком gein, либо везикулярным ингибирующим аминокислотным транспортером.

Здесь показано эндоцитоз альфа-2, содержащего рецептор ГАМК А и нейроны гиппокампа, на 15-е сутки in vitro с альфа-бунгалотоксином. Флуоресцентные измерения отдельных дендритных процессов, как показано на панелях, нормализованы до уровня экспрессии конструкта через антитела GFP. Окрашивание итогового сравнения временных точек производится путем нормализации до T равно нулю измерения.

Количественная оценка интернализации рецепторов в течение 60-минутного периода по изменениям флуоресцентного сигнала с течением времени лучше всего описывается одной экспоненциальной. Альтернативный подход заключается в отслеживании рецепторного эндоцитоза в одном нейроне с помощью покадровой конфокальной микроскопии в реальном времени. Точечная и перекрывающаяся флуоресценция меченного P-H-G-F-P рецептора ГАМК А и рецепторов, меченных поверхностным альфа-бунгалотоксином, видна в начале эксперимента, в течение которого сигнал рецептора альфа-бунгало, меченного ГАМК А, уменьшается по мере эндоцитоза рецепторов.

В то время как сигнал P-H-G-F-P остается высоким из-за вставки новых рецепторов, минимальное снижение сигнала P-H-G-F-P связано с изменениями распределения рецепторов на клеточной поверхности и фотообесцвечиванием. Другие методы, такие как анализ введения бунгало-токсина, могут быть выполнены, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как скорость введения рецепторов при различных методах лечения. Этот метод позволяет оценить, как клеточная активность, специфические белковые домены, агонисты и другие модуляторы могут изменять оборот рецепторов в живых нейронах, других клетках и тканях.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать красители Alexa, связанные с альфа-бунгало в сочетании со стандартными иммунофлуоресцентными методами, для количественной оценки локализации поверхностных рецепторов в нейронах гиппокампа.