Тонкослойная Хроматографическое (ТСХ) Разделение и Биоанализы растительных экстрактов для идентификации антимикробные соединения

Общая цель этой процедуры заключается в выявлении растительных метаболитов, которые являются антимикробными для анаэробных бактерий. Это достигается путем выделения растительного экстракта с помощью тонкослойной хроматографии или ТСХ. Далее хроматограмма разрезается на зоны, содержащие одно или несколько соединений.

Затем зоны помещают на агар, инокулируют анаэробными бактериями и инкубируют. После инкубации зоны удаляются, а пластины окрашиваются для выявления соединений, которые подавляют рост бактерий. Полученные данные свидетельствуют о наличии или отсутствии антимикробных растительных метаболитов.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области питания жвачных животных, например, каково влияние вторичных метаболитов растений на использование питательных веществ конкретными микроорганизмами. Хотя этот метод выявляет растительные соединения, которые подавляют бактерии рубца. Его также можно применять для выявления соединений, ингибирующих другие бактерии или грибы.

В этом протоколе фенольные соединения из красного клевера будут использованы для демонстрации идентификации антимикробных соединений по контактной биографии. Начните с очистки тонкослойных хроматографов или пластин TLC, работающих в вытяжном шкафу. Приготовьте достаточное количество чистящего растворителя, чтобы покрыть дно камеры проявки TLC, а также нижний край пластины TLC.

При установке в камеру здесь готовится этилацетатметанол два к одному. Далее надеваем перчатки и работаем в вытяжном шкафу. С помощью ножниц разрежьте алюминиевые или пластиковые гибкие пластины из кремнезема, чтобы они соответствовали камере проявки.

Вставьте пластины в камеру так, чтобы верхушки прислонились к стенкам камеры. Пластины не должны соприкасаться друг с другом. Накройте камеру и дайте растворителю двигаться вверх по пластинам за счет капиллярного действия.

Когда растворитель достигнет верха пластин, извлеките их из камеры и расположите в стоячем положении в вытяжном шкафу до тех пор, пока растворитель не испарится. Когда пластины высохнут, проверьте, не мигрировали ли примеси в верхнюю часть пластин TLC. Они будут выглядеть как желтая полоса в видимом свете или флуоресцентная полоса в ультрафиолетовом свете.

Если большая часть пластины все еще имеет желтоватый оттенок, повторите процесс очистки в той же камере TLC с использованием того же растворителя. После извлечения пластин TLC из камеры выбросьте растворитель. Дайте остаточному растворителю полностью испариться перед использованием камеры для следующей части протокола.

Далее, чтобы удалить остаточную влагу, которая может повлиять на миграцию соединений на диоксид кремния, поставьте пластины вертикально в сушильную печь при температуре 100 градусов Цельсия на 10-15 минут для пластины размером 20 на 20 сантиметров и пять минут для пластин размером семь на 10 сантиметров. Как только пластины высохнут, дайте им остыть до температуры окружающей среды, прежде чем загружать их экстрактами. Чтобы подготовить камеры к отделению экстракта, с помощью ножниц отрежьте кусок фильтровальной бумаги чуть ниже высоты камеры и примерно половины периметра камеры в ширину.

Эта бумага будет действовать как фитиль для втягивания растворителей вверх по стенке камеры и насыщения камеры бумагой для растворителей, тем самым улучшая воспроизводимость разделения. В качестве растворителей используется этилацетатметанол в соотношении четыре к одному объему на объем. Залейте смесь растворителей в камеру и накройте крышкой.

С помощью карандаша слегка отметьте начало координат в точке на пластине TLC, которая будет находиться над поверхностью проявляющегося растворителя в камере. Если абсорбент пластины TLC мягкий и его легко повредить, сделайте отметки по краям, как показано здесь. Далее растворите экстракты в достаточном количестве органического растворителя, чтобы вместо мутной суспензии получился концентрированный раствор.

Здесь в качестве растворителя используется метанол. Использование капиллярных микропипеток или микролитрового шприца загружает эталоны и образцы в виде узких полос, оставляя при этом границу в один сантиметр по бокам пластины, дают полосам высохнуть, обмахивая пластину веером или загружая ее в вытяжной шкаф, помогает быстрее высушить ленты. После того, как ленты высохнут, снова загрузите образцы на то же место или поверх него.

Если требуется большая концентрация образца на планшете, повторите по мере необходимости в камере TLC. Следите за тем, чтобы весь фитиль пропитался растворителем. Затем с помощью щипцов или щипцов поместите пластины внутрь камеры TLC.

Пластины не должны касаться фитиля. Накройте камеру и дайте пластинам проявиться, прежде чем фронт растворителя достигнет верхней части пластины. Снимите пластины с бака TLC и отметьте карандашом высоту фронта растворителя.

Дайте тарелке высохнуть. В вытяжном шкафу разработайте все оставшиеся пластины TLC в той же камере TLC, которую обычно можно использовать в течение всего дня, если держать закрытой. Если количество растворителя в камере заметно уменьшается, внесите больше смеси растворителей после того, как пластины высохнут.

Визуализируйте полосы в видимом или ультрафиолетовом свете. Смотровая камера с портативной УФ-лампой удобна, особенно если лампа может обнаруживать соединения как в коротковолновом ультрафиолетовом диапазоне 254 нанометра, так и в длинноволновом ультрафиолетовом диапазоне 365 нанометров. С помощью карандаша очертите полосы с помощью гелевой системы фотодокументации, оснащенной верхним, ультрафиолетовым и/или видимым светом, чтобы получить изображения пластин.

Наконец, чтобы помочь в определении характеристик полос, рассчитайте коэффициент удержания или значения РЧ, сначала измерив расстояние, пройденное соединением, затем измерив расстояние, пройденное растворителем, и разделив его на лестницу. После того, как местоположения полос будут отмечены, пластины можно сохранить на потом. Использование в биопробе.

Заверните тарелки в полиэтилен и накройте их фольгой. Храните тарелки при температуре минус 20 градусов по Цельсию. Максимальное время хранения зависит от стабильности соединения, поскольку диоксид кремния не является нейтральным.

Некоторые соединения могут разлагаться во время нахождения на пластине TLC. При подготовке к анализу контактной биографии получают и инокулируют бактерии, продуцирующие гипераммиак, или среду ВЦВ в анаэробных условиях. В данном случае используется культура Clostridium stickland eye strain sr.

Выращивайте культуру до экспоненциальной или стационарной фазы при температуре 39 градусов Цельсия. Используйте стерильные анаэробные методики при работе с анаэробными микроорганизмами. Приготовьте ноль целых 75% веса на объем.

Агар в той же среде, в которой выращиваются бактерии, после того как температура агара снизилась до менее чем 60 градусов по Цельсию. Инокулируйте расплавленный агар в 1%-ный объем на объем культуры и аккуратно перемешайте, немедленно поместите его в анаэробную камеру и залейте ножницами в пластиковые чашки Петри размером 15 на 100 миллиметров. Разрежьте пластину TLC на зоны, содержащие полосу или полосы интереса.

С помощью шарпи размечаем заднюю сторону пластин. Поместите неиспользованную полоску TLC на агаровую пластину в качестве контроля. Затем положите ленты лицевой стороной вниз на агаровые пластины.

Инкубируйте пластины агаровой стороной вниз в анаэробной камере. Инкубатор на 24 часа при 39 градусах Цельсия с помощью щипцов. Снимите ленты TLC с агаровых пластин, пока они находятся в анаэробной камере.

Добавьте тетра олеум красный по каплям на поверхность агаровых пластин. Дайте цвету проявиться не менее 20 минут. Когда контрольная пластина полностью покраснеет, извлеките пластины из анаэробной камеры.

Clostridium stick Landi является анаэробной бактерией, поэтому она начнет терять жизнеспособность сразу после удаления из анаэробной камеры, но цвет стабилен более 24 часов. С помощью цифрового фотоаппарата фотографируйте пластины под видимым светом на фоне, обеспечивающем достаточный контраст. Ярко-красный цвет будет наблюдаться при окрашивании живых клеток.

Омертвевшие клетки не окрашиваются. Здесь показано репрезентативное разделение диоксида кремния, TLC экстрактов красного клевера, содержащих фенольные соединения. Разделение гексана этилацетата девять к одному на протяжении 8,5 см привело к образованию пяти полос, одна из которых полностью растворилась от источника.

Загруженными стандартами были Formin Bio, Canon A и Genine. Четыре полосы с этой пластины были нанесены на культуры с Clostridium Landi, бактерией, производящей гипераммиак рубца в течение 24 часов, и окрашены красным тетраолеумом, как описано здесь. Инкубация с первой полосой Bio Canon A и частью группы two four Monon nein на засеянном бактериями агаре привела к образованию четко определенной зоны ингибирования.

Тем не менее, инкубация оставшейся части второй полосы, а также третьей и четвертой полос не подавляла рост бактерий. Эти результаты показали, что био Канон А подавляет рост глаз в виде стикленда, а форма Аон Нейн — нет. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что техника является гибкой.

Можно использовать другие тестовые микроорганизмы при условии выбора подходящей среды и включения средств контроля, гарантирующих, что химический состав разделения и метод обнаружения совместимы в соответствии с этой процедурой. Другие методы, такие как высокоэффективная жидкостная хроматография и масс-спектрометрия, могут быть использованы для определения характеристик антимикробных соединений, идентифицированных в биоанализе.