Стабилизация Гепатоцеллюлярной Фенотип используя оптимизированные синтетические покрытия

Общая цель этой процедуры заключается в оптимизации поверхностей с полимерным покрытием для сохранения в долгосрочной перспективе стабильной культуры гепатоцитов человека, полученных из стволовых клеток. Это достигается путем предварительного синтеза полиуретана 1 3 4 или PU 1 3 4. Вторым шагом является выбор правильного растворителя для растворения PU 1 34.

Затем оптимизируется процесс нанесения плюрома с помощью PU 1 3 4 на стеклозащитном покрове. Заключительным этапом является оптимизация процедуры стерилизации стеклянных покровных изделий с полимерным покрытием P 1 34, в конечном итоге с помощью сканирующей электронной микроскопии, атомно-силовой микроскопии и метаболизма лекарственных препаратов. Анализы используются для того, чтобы показать влияние полимерного покрытия PU 1 34 на функцию гепатоцитов, полученных из стволовых клеток.

Основное преимущество этого метода по сравнению с существующими методами, такими как использование al Metrices в культуре для поддержания URI мощных стволовых клеток, имеющих гепатоциты, заключается в том, что эти синтетические материалы могут быть точно настроены по назначению и в масштабе в соответствии со стандартами гарантированного качества. Кроме того, они демонстрируют согласованность шины второго пакета. Применение этого метода распространяется и на терапию заболеваний печени, поскольку он представляет собой пример того, как поверхность синтетического полимера может быть оптимизирована для сохранения клеточного фенотипа.

Демонстрировать процедуру будет доктор Джеффри Уолтон, постдок из моей лаборатории до начала этой процедуры. Примените термическую обработку к одному, шести гексановому циферблату моно этиленгликолем и гликолем neo PenTile при температуре 40 градусов Цельсия в течение 48 часов в вакуумной печи. Чтобы удалить остатки воды, добавьте 22 миллимоля каждого мономера и 55 миллимолей дпиевой кислоты в колбу с круглым дном с двумя горлышками, подключенную к аппарату Дина Старка и оснащенную магнитной мешалкой.

После этого поместите всю сборку в вакуум и осторожно нагрейте стеклянную посуду до 40 градусов Цельсия в течение шести часов, чтобы избежать любого поглощения влаги во время добавления химиката в колбу. Сняв узел с печи и поместив систему под азот, добавьте в колбу 0,0055 моля титанового катализатора, но оксид по каплям с помощью шприца. Перемешивайте реакционную смесь при температуре 180 градусов Цельсия в течение 24 часов, собирая остатки воды в ловушке Дина Старка.

Дайте изделию остыть до комнатной температуры. Затем смешайте 3,2 миллимола, или один эквивалент полиола P-H-N-G-A-G с 6,4 миллимоль или два эквивалента четырех, четырех метилов и бисфенолизоцианата. В 12 миллилитрах безводного ДМЛ в двугорлышую круглую донную колбу, соединенную с деканским аппаратом Старка и снабженную магнитной звездочкой.

Перемешайте реакционную смесь при температуре 70 градусов Цельсия в атмосфере азота. Затем добавьте в катализатор четыре оксида титана по каплям через шприц до конечной концентрации 0,8%Через час добавьте один эквивалент удлинителя цепи один четыре бутана для получения сополимерного продукта. Увеличьте температуру до 90 градусов по Цельсию и голодайте в течение 24 часов под атмосферой азота.

После того, как реакционная смесь вызвала комнатную температуру, эфир дал капляется в реакционную смесь до тех пор, пока не произойдет осаждение полиуретанового продукта. После переноса реакционной смеси в центрифужную пробирку центрифугировать раствор при 5,300 G в течение пяти минут. После декантации супинат подсыхает при комнатной температуре до испарения растворителя.

Работает далее весом 200 миллиграмм PU 1:34 в стеклянную бутылку. Разбавьте образец до конечной концентрации 2% в хлороформе или хлороформе и толуоле в соотношении один к одному, или тетра роран, или комбинации тетра роран антихлорметан. В соотношении один к одному энергично встряхивать раствор в течение 20 минут при комнатной температуре с помощью шейкера со скоростью 200 движений в минуту до тех пор, пока раствор не станет однородным и не будет наблюдаться выпадения осадка.

Когда закончите, поместите около 15-миллиметровой квадратной стеклянной крышки на спиннинговый котер. Нанесите 50 микролитров раствора полиуретана от одного до четырех на покровный лист с помощью пипетки и отжимайте каждый покровный лист в течение семи секунд при 23-кратном G. Затем высушите покровный лист на воздухе при комнатной температуре в течение не менее 24 часов перед стерилизацией. На этом этапе гамма-излучение облучает каждую покровную крышку с полимерным покрытием, применяя дозу 10 грей с помощью лабораторного излучателя в течение 12 минут.

В качестве альтернативы можно облучать УФ-излучением каждую крышку с полимерным покрытием с помощью УФ-лампы мощностью 30 Вт в течение 16 минут с каждой стороны. По завершении поместите защитный лист с полимерным покрытием в подходящую планшет для культуры тканей в соответствии с размером покровного стекла. После культивирования и дифференцировки линии эмбриональных стволовых клеток человека клетки отделяют с помощью диссоциационного реагента и воспроизводят их на покрытых покрытием PU 1 34 листках на девятый день процесса дифференцировки в присутствии сканирующей электронной микроскопии свободной сыворотки сыворотки.

Изображения защитных стекол с различным покрытием показывают, что покрытие толуолом или хлороформом не было однородным, что свидетельствует о неравномерном покрытии осадками PE 1 34. В отличие от этого, тетраэдран позволял наносить спиновое покрытие на гораздо более однородную поверхность. Кроме того, атомно-силовой микроскопический анализ различных полимерных покрытий показал 40%-ное снижение шероховатости P 1 34, растворенного в тетрагидрофурине, по сравнению с другими растворителями, демонстрируя более однородное покрытие PU 1 34 при биологическом применении, была индуцирована дифференцировка эндодермы печени, и на девятый день гепатобласты, подобные клеткам, были очевидны, причем большинство клеток экспрессировали цитокератин 19 альфа-фета и ядерный фактор гепатоцитов для альфа и низкий уровень альбумина как показатель метаболической функции.

Функция цитохрома P 4 50 оценивалась через четыре дня после нанесения на различные поверхности с полимерным покрытием. Наблюдалось двукратное увеличение метаболической активности в клетках, покрытых на поверхностях с покрытием tetra hydro fure mpu 1 3 4. Эти результаты демонстрируют, что метаболическая активность гепатоцитов, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека, улучшается с более однородным покрытием лица P 1 34 Контрастная визуализация не показала существенных различий после ультрафиолетового или гамма-облучения, что было дополнительно подтверждено анализом сканирующей электронной микроскопии.

Гепатоциты, полученные из эмбриональных стволовых клеток человека, покрытые на стеклянных покровных листках с гамма-излучением PU 1 34, показали трехкратное увеличение активности CYP 3 a по сравнению с клетками, покрытыми УФ-излучением PU 1 34. Эти наблюдения показывают, что гамма-излучение является оптимальным методом стерилизации. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно не забывать проверять однородность покрытия между различными спиннинговыми покрытиями CLO, и не забывать, что работа с химическими растворителями может быть чрезвычайно опасной.

Во время выполнения этой процедуры всегда следует применять такие приложения, как ношение защитных очков.