Определение концентрации вируса через бляшки Анализы: используя традиционные и новейшие системы Наложение

Общая цель данной процедуры — определить концентрацию вируса путем количественного определения инфекционных вирионов путем подсчета отдельных бляшек в клеточной культуре. Сначала клетки высевают для формирования слитного монослоя для последующего заражения. Вторым этапом является выполнение серийных разведений исследуемого образца вируса для количественного анализа. Затем слитные монослои заражают серией разведений вирусного стока с последующим нанесением иммобилизирующего оверлея. Заключительным этапом является фиксация и окрашивание бляшек после соответствующего времени инкубации для конкретного вируса с целью подсчета отдельных бляшек. В конечном итоге метод анализа бляшек может быть использован и модифицирован различными способами для определения вирусного титра неизвестного образца вируса.

Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими способами, такими как метод полутвердого агарового слоя, является то, что нанесение и удаление слоя значительно проще как при высокопроизводительном скрининге, так и в традиционных исследованиях. Кроме того, нагрев реагентов не требуется. Возможности применения этой методики распространяются на исследование многих различных литических вирусов, так как использование жидкого слоя в 96-луночном формате позволяет проводить быстрый скрининг новых терапевтических соединений, что может существенно сократить время пребывания в лаборатории при выполнении традиционного анализа методом бляшек.

За день до проведения анализа высейте соответствующие клетки для исследуемого вируса, чтобы к дню инфицирования они достигли 90–100% конфлюэнтности. Стоковые растворы также можно приготовить накануне анализа. Сначала приготовьте фиксирующий раствор 10% формальдегида в дистиллированной воде, смешав 5,56 миллилитра 36% стокового формальдегида с 14,44 миллилитрами дистиллированной воды. Затем приготовьте краситель кристаллический фиолетовый, состоящий из 1% кристаллического фиолетового в 20% этаноле, разведенного дистиллированной водой. Далее, работая в стерильных условиях, приготовьте соответствующую 2-кратную среду для метода бляшек в зависимости от используемого типа клеток. Профильтруйте раствор через фильтр 0,2 микрона, если какой-либо из реагентов не является стерильным. Для приготовления жидкого оверлея, используемого в анализе бляшек, добавьте 2,4 грамма Avicel в колбу, содержащую 97,6 миллилитра дистиллированной воды, при интенсивном перемешивании с помощью магнитной мешалки. Перемешивайте раствор при комнатной температуре до тех пор, пока он не станет слишком вязким для магнитной мешалки. После этого перенесите колбу на шейкер и интенсивно встряхивайте ее в течение 30 минут для обеспечения равномерной гомогенизации. В завершение автоклавируйте раствор при 121 °C и давлении 14 PSI в течение 30 минут.

По завершении программы храните герметично закрытый флакон при комнатной температуре. Для создания агарозного слоя приготовьте 0.6% стоковый раствор агарозы в дистиллированной воде, перемешайте с помощью магнитной мешалки и автоклавируйте до полного растворения. Для создания слоя из карбоксиметилцеллюлозы приготовьте 2% раствор карбоксиметилцеллюлозы в дистиллированной воде и перемешайте. Затем автоклавируйте аналогичным образом.

На следующий день после посева с помощью инвертированного микроскопа проверьте конфлюэнтность и жизнеспособность клеток перед началом анализа. Убедитесь, что клетки имеют стандартную морфологию и конфлюэнтность составляет примерно 90%.

Выполните десятикратное серийное разведение инфицированных образцов в среде для культивирования клеток, варьируя количество необходимых разведений в зависимости от ожидаемого титра соответствующего вируса. Также подготовьте неинфицированный контрольный образец, чтобы независимо подтвердить жизнеспособность клеток и облегчить идентификацию бляшек. Перенесите пипеткой неинфицированный контроль и серийные разведения в лунки планшета, стараясь не нарушить монослой.

Используйте достаточный объем инокулята, чтобы полностью покрыть клетки, при этом стараясь максимально уменьшить его объем для обеспечения наиболее интенсивного контакта вируса с монослоем. Поместите планшеты в инкубатор для культивирования тканей и инкубируйте клетки с вирусом от 45 минут до одного часа. Каждые 20 минут осторожно покачивайте планшеты, чтобы обеспечить равномерное распределение и предотвратить высыхание клеточного монослоя.

Во время инфицирования приготовьте рабочий раствор для жидких оверлеев. Смешайте подогретую среду для формирования бляшек и стоковый раствор Avicel (1,2–2,4% при комнатной температуре) в соотношении один к одному, чтобы получить рабочий раствор среды для оверлея с концентрацией Avicel 0,6–1,2%. Для оверлеев с агарозой или КМЦ смешайте подогретую среду для формирования бляшек со стоковым раствором либо нагретой 0,6% агарозы, либо 2% КМЦ в соотношении один к одному. Затем поместите смесь в водяную баню при 56 °C на 30 минут для выравнивания температуры. Убедитесь, что раствор теплый, но не горячий на ощупь, чтобы предотвратить гибель клеток и снижение вирусного титра. После инфицирования нанесите оверлеи на инфицированные монослои. После добавления оверлея инкубируйте планшеты при 37 °C и 5% carbon dioxide от двух до 14 дней, в зависимости от анализируемого вируса.

Для фиксации клеток при использовании жидкого слоя слейте или аспирируйте слой Avicel, затем внесите пипеткой 10% раствор формальдегида в лунки и фиксируйте при комнатной температуре от 30 минут до ночи. Для агарозы или CMC добавьте раствор формальдегида непосредственно в слой на время от одного часа до ночи при комнатной температуре. После фиксации удалите формальдегид, а затем вручную извлеките полутвердые пробки агарозы с помощью шпателя.

Промойте клеточные плашки Avicel водой, чтобы удалить остатки фиксатора верхнего слоя перед окрашиванием.

Для окрашивания покройте клетки минимальным количеством раствора кристаллического фиолетового примерно на 15 минут. При необходимости покачивайте планшеты для обеспечения равномерного покрытия. Осторожно смойте краситель кристаллического фиолетового водой. После фиксации, окрашивания и высушивания бляшки можно хранить неопределенное время для последующего анализа. Подсчитайте количество бляшек в каждой лунке, исключая лунки, в которых менее пяти или более 100 бляшек. Вычислите среднее значение для технических повторностей одного и того же разведения. Обратите внимание на размер и морфологию бляшек. Определите вирусный титр стокового образца, рассчитав среднее количество бляшек для данного разведения и умножив его на обратную величину общего коэффициента разведения.

На этом изображении представлены результаты сравнения методов наложения оверлея для определения бляшек вируса лихорадки Рифт-Валли с использованием 12-луночных планшетов. Клетки Vero высевали в 12-луночные планшеты в концентрации 2,5 × 10⁵ клеток на лунку и заражали 200 µL одного и того же серийно разведенного исходного образца MP 12. После заражения для прямого сравнения наносили оверлеи объемом 1,5 мл, состоящие из 0,3% агарозы, 0,6% Avicel или 1% CMC. На данной гистограмме показаны результаты подсчета бляшек и определения титра для всех трех типов оверлея. Здесь представлены результаты сравнения методов наложения оверлея для VEEV с использованием 12-луночных планшетов. Клетки Vero высевали так же, как описано выше, и заражали объемом 200 µL одного и того же серийно разведенного исходного образца вакцинного штамма VEEV-TC 83; после заражения, как и прежде, наносили оверлеи объемом 1,5 мл из 0,3% агарозы, 0,6% Avicel или 1% CMC.

Снова на гистограмме представлены результаты подсчета бляшек и определения титров для всех трех вариантов наложений. На данном изображении приведен пример высокопроизводительного метода наложения бляшек. Пластину на 96 лунок с клетками Vero, рассеянными из расчета 3 × 10⁴ клеток на лунку, заражали 50 µL инокулята, используя те же серийные разведения исходного образца вируса лихорадки Рифт-Вэлли штамма MP 12, в течение одного часа в четырех повторностях. Для наложений были протестированы конечные концентрации Avicel 0,6% и 1,2%, чтобы определить возможность и воспроизводимость использования жидких наложений в высокопроизводительном режиме. На этой гистограмме показаны титры, определенные для каждого варианта наложения.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что каждый вирус уникален, и может потребоваться оптимизация, включая использование других типов клеток, изменение времени инкубации и/или состава ростовой среды. После просмотра этого видео вы должны четко понимать, как проводить базовой анализ бляшек с использованием жидких и полутвердых оверлеев.