Минимально инвазивная техника для инъекций в Крыса зрительного нерва
19 мая 2015 г.
Прямая инъекция в зрительный нерв крысы полезна для регенеративных исследований. Мы демонстрируем минимально инвазивную технику прямой инъекции в зрительный нерв крысы, которая не предполагает вскрытия черепа. При использовании этого метода хирургические осложнения сводятся к минимуму, а восстановление проходит более быстро.
Общая цель данной процедуры заключается в обеспечении малоинвазивного подхода для введения лекарственных препаратов или стволовых клеток в зрительный нерв живой крысы. Для этого сначала крысу анестезируют, помещают на диссекционный стенд и вводят шовный материал в конъюнктиву для манипуляций с глазом. Следующим этапом является рассечение тканей в области орбитального края за глазом для обнажения зрительного нерва.
Затем стеклянную пипетку вводят в зрительный нерв, после чего вводят препарат или стволовые клетки, затем операционное поле закрывают, и крысу выводят из наркоза. В конечном итоге, по прошествии определенного периода времени, крысу усыпляют, проводят диссекцию зрительного нерва, и результаты хирургической инъекции или трансплантации визуализируют с помощью микроскопии. Основным преимуществом этой методики по сравнению с существующими методами является то, что данный подход минимально инвазивен, что позволяет поддерживать жизнь крысы в течение необходимого вам времени.
Изучите эффекты хирургической инъекции или трансплантации. Процедуру продемонстрирует Кейт Шварц, студент-техник из моей лаборатории. Все хирургические манипуляции следует проводить под анестезией с использованием 2–3% isof fluorine.
Подтвердите достижение соответствующего уровня анестезии с помощью щипка за палец лапы и оценки частоты дыхания. Убедитесь, что крыса не вздрагивает в ответ на щипок за палец. При необходимости зафиксируйте животное, чтобы избежать смещения головы во время процедуры.
Затем нанесите каплю лидокаина на оперируемый глаз. Каждые 10 минут используйте искусственные слезы для предотвращения пересыхания роговицы во время анестезии. Сделайте предоперационную подкожную инъекцию бупренорфина в дозе 0,01 мг/кг, затем повторяйте процедуру каждые шесть-восемь часов по мере необходимости.
Обеспечьте животному тепло с помощью грелки. Смочите шерсть на коже головы спиртом, стараясь не допустить попадания вещества в глаза.
Обязательно используйте стерильные инструменты и соблюдайте правила асептики, чтобы свести к минимуму риск послеоперационных инфекций. Затем наложите шов нитью 4-0 на латеральную конъюнктиву и завяжите его, оставив достаточный конец нити для обеспечения мягкой тракции. Сделайте разрез кожи длиной примерно один дюйм над орбитальным краем.
Используя скальпель с лезвием № 10, раздвиньте кожу и подлежащую фасцию, после чего осторожно отсекулируйте фасцию. Наложите один шов на раздвинутую кожу, чтобы обеспечить доступ к верхнему орбитальному мешку и предотвратить избыточное кровотечение в операционную рану.
Избегайте повреждения кровеносных сосудов при рассечении фасции. При осторожном натяжении конъюнктивы, когда глаз оттягивается вниз и наружу из орбиты, в поле зрения появится верхняя прямая мышца глаза. Для обнажения зрительного нерва необходимо удалить ретроорбитальный жир и пересечь эту мышцу.
Жировую ткань можно удалить; после инъекции ее заменять не следует. На данном этапе фасция зрительного нерва должна стать видна как пучок самого зрительного нерва вместе с кровеносными сосудами, заключенными в твердую мозговую оболочку. Для проведения более глубокого препарирования сделайте небольшой разрез в DRA с помощью скальпеля или косой иглы 31 G, чтобы сделать прокол менее травматичным; для обеспечения стабильности используйте заранее подготовленную стеклянную микропипетку с диаметром от 50 до 100 микрон.
Установите микропипетку на микроманипулятор и подсоедините её к пластическому шприцу объемом 20 cc. Втяните в микропипетку ретроградно бусины или стволовые клетки, реконструированные в 0,5–1 µL, вместе с 0,5 µL раствора метилового синего до и после заполнения стеклянной пипетки красителем. С помощью шприца объемом 1 cc и иглы 30G опустите кончик микропипетки на зрительный нерв сразу над надрезом твердой мозговой оболочки.
Небольшое, но резкое движение стеклянного наконечника в зрительный нерв при одновременном медленном и постоянном нажатии на plunger приводит к минимальному повреждению. Краситель «Эванс блю» должен окрасить область инъекции в зрительном нерве. Краситель должен оставаться локализованным внутри зрительного нерва, не вытекая в субарахноидальное пространство.
Следите за второй полосой красителя Evans Blue, чтобы определить момент завершения инъекции стволовых клеток. Когда необходимый объем будет введен в зрительный нерв, отпустите плунжер. Оставьте микропипетку в зрительном нерве на пять минут, чтобы предотвратить выброс содержимого из-за высокого давления при извлечении микропипетки после завершения инъекции.
Извлеките микропипетку вместе с ватными тампонами, использовавшимися для обеспечения гемостаза. Зашейте кожу шелком 3.0 и удалите шов на конъюнктиве. Держите крыс в тепле на грелке до полного пробуждения от наркоза.
Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока оно не придет в сознание в достаточной степени, чтобы поддерживать положение лежа на груди. Если у животного наблюдаются признаки боли, включая чрезмерную вялость, атаксию или затрудненное дыхание, введите соответствующий анальгетик — бупренорфин внутримышечно до трех раз в день. После завершения эксперимента крыс усыпили и перфузировали паральдегидом.
Зрительные нервы были осторожно препарированы и закреплены для получения срезов на криостате; здесь представлен пример целого зрительного нерва крысы при малом увеличении, в который был введен краситель Эванса синий. Для визуализации места введения стрелка указывает точное место инъекции. Данное препарирование было выполнено через несколько дней после инъекции, о чем свидетельствует ограниченная диффузия красителя по нерву после его развития.
Эта методика открыла исследователям в области регенеративной неврологии путь к поиску новых способов регенерации зрительного нерва и потенциальному восстановлению утраченного зрения на данной крысиной модели демиелинизирующего заболевания.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлена малоинвазивная методика прямой инъекции в зрительный нерв крысы, предназначенная для совершенствования исследований в области регенерации. Данный метод сводит к минимуму хирургические осложнения и способствует более быстрому восстановлению подопытных животных.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Регенеративная медицина
- Хирургия животных
Введение
- Прямое введение в зрительный нерв имеет решающее значение для изучения регенеративных процессов.
- Традиционные методы часто предполагают инвазивные процедуры, которые могут привести к осложнениям.
- Данная методика направлена на улучшение выживаемости и восстановление подопытных субъектов.
- Понимание воздействия инъекций на зрительный нерв жизненно важно для разработки будущих методов терапии.
Цель исследования
- Разработать менее инвазивный метод введения лекарственных препаратов или стволовых клеток в зрительный нерв.
- Минимизировать хирургические риски и сократить время восстановления на моделях животных.
- Облегчить изучение регенеративных эффектов после инъекции.
Используемые методы
- Анестезия крысы перед началом процедуры.
- Размещение крысы на диссекционном стенде для обеспечения оптимального доступа.
- Диссекция орбитального края для обнажения зрительного нерва.
- Введение препарата или стволовых клеток с помощью стеклянной пипетки.
Основные результаты
- Данная методика позволяет успешно проводить инъекции без вскрытия черепа.
- Крысы восстанавливаются быстрее по сравнению с традиционными методами.
- Послеоперационное обследование показывает, что эффекты инъекций можно визуализировать.
- Метод обеспечивает выживаемость крыс для длительных периодов наблюдения.
Выводы
- Этот малоинвазивный метод эффективен для проведения инъекций в зрительный нерв.
- Он позволяет снизить риск осложнений и ускорить процесс восстановления.
- Данный подход имеет важное значение для будущих исследований в области регенеративной нейробиологии.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Этот малоинвазивный метод позволяет осуществлять прямую доставку терапевтических агентов в зрительный нерв крысы без трепанации черепа, что делает возможным проведение лонгитюдных исследований в области регенеративной неврологии. Сохраняя жизнеспособность животных и снижая хирургическую травматизацию, данный подход повышает осуществимость экспериментов по хроническому введению препаратов и трансплантации стволовых клеток. Этот метод повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней для стратегий восстановления зрительного нерва и снижает риски при трансляционном переносе результатов на модели демиелинизирующих заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем прямой доставки стволовых клеток или лекарственных препаратов в зрительный нерв.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию мишени за счет локального воздействия без влияния системных эффектов.
- Прогностическая ценность: способствует снижению механистических рисков, позволяя визуализировать места инъекций и дисперсию маркера с помощью красителя бриллиантового синего.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Создает стандартизированную, воспроизводимую хирургическую платформу для доставки соединений или клеток в зрительный нерв.
- Количественный результат: Позволяет оценить успешность инъекции по локализации красителя и с помощью послеоперационной микроскопии.
- Масштабируемость: Обеспечивает возможность повторных вмешательств благодаря быстрому восстановлению и минимальной инвазивности.
Трансляционные и доклинические исследования
- Клиническая значимость: Моделирует повреждение и демиелинизацию зрительного нерва, что соответствует задачам разработки методов терапевтического восстановления зрения.
- Трансляционная преемственность: Связывает этап фундаментальных открытий с доклинической валидацией, обеспечивая возможность длительного наблюдения за регенеративными эффектами.
- Принятие решений с учетом рисков: Поддерживает критерии принятия решения о продолжении или прекращении исследования («go/no-go») на основе гистологического подтверждения точности инъекции и тканевого ответа.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод интегрируется в процесс разработки — от проверки гипотез и идентификации перспективных соединений до доклинической валидации, что позволяет осуществлять итерационное проектирование нейротерапевтических препаратов.
- Открывающая биология (Discovery Biology): способствует уточнению сигнальных путей путем доставки агентов непосредственно в зрительный нерв для оценки взаимодействия с мишенью.
- Скрининг: повышает надежность анализа за счет стабильной, минимально инвазивной доставки, исключающей хирургическую вариабельность.
- Аналитика: обеспечивает количественные показатели посредством удержания красителя и гистологического секционирования для сравнения эффективности инъекций.
- Трансляционные исследования: обеспечивают преклиническую преемственность, позволяя поддерживать периоды выживаемости, достаточные для оценки регенерации.
- Корпоративное повторное использование: создает возможность повторного применения хирургического метода в нескольких исследованиях, направленных на восстановление зрительного нерва.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает точность прогнозирования модуляции мишени и снижает механистическую неопределенность в исследованиях зрительного нерва.
- Практическая ценность: улучшает стандартизацию и воспроизводимость внутримозгового введения в моделях грызунов.
- Стратегическая ценность: снижает биологические риски на поздних этапах за счет возможности ранней проверки точности доставки и переносимости тканями.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации кандидатов для нейрорегенерации с учетом рисков на основе технической осуществимости доставки.
Рекомендации по внедрению
- Требуется опыт в области микрохирургии и протоколов анестезии грызунов.
- Зависит от наличия микрошприца, стеклянных микропипеток и оборудования для стереотаксических манипуляций.
- Необходим стандартизированный послеоперационный уход, включая анальгезию и терморегуляцию.
- Требует учета особенностей адаптации для различных линий грызунов или диаметров нервов.
- Ограничено необходимостью проведения терминального вскрытия для подтверждения места инъекции, что исключает возможность продольного прижизненного имиджинга.
