Создание человека эпителиальных Enteroids и Colonoids из цельной ткани и биопсия

Общая цель этой процедуры заключается в том, чтобы получить человеческие входы из тканей кишечника. Это достигается путем предварительного рассечения слизистой оболочки кишечника из подлежащей подслизистой ткани. Вторым шагом является инкубация слизистой оболочки с ЭДТА, чтобы способствовать диссоциации эпителия от соединительной ткани.

Далее кишечные крипты отделяются от диссоциированного эпителия. Наконец, кишечные крипты культивируются в матрице базальной мембраны. В конечном счете, методы иммуногистохимии используются для демонстрации эпителиальной организации, а также специфических эпителиальных маркеров культивируемых OIDs.

Смысл этого метода заключается в том, что теперь мы можем создавать OID из биопсии конкретного пациента, а это означает, что теперь мы можем использовать эту ткань в лаборатории для изучения кишечных заболеваний и диагнозов, что до сих пор мы никогда не могли сделать. После подготовки буферов и реагентов, согласно текстовому протоколу, разморозьте базальную мембрану на льду и предварительно инкубируйте 24-луночный планшет в инкубаторе с углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия, когда ткань будет получена. Используйте PBS от KO без кальция и магния или DPBS для промывания ткани до тех пор, пока DPBS не станет прозрачной.

Поместите салфетку в стеклянную чашку Петри с силиконовым покрытием, наполненную ледяным DPBS стороной слизистой оболочкой вверх, и булавками минучина закрепите ткань, растягивая и прикалывая ее. Затем под микроскопом для препарирования с помощью микроножниц и тонкозаострых изогнутых щипцов удалите подлежащую слизистую оболочку из подслизистой оболочки и соединительной ткани. Затем стороной слизистой вверх растяните и приколите рассеченную слизистую оболочку плашмя на стеклянной чашке Петри с силиконовым покрытием.

С помощью изогнутых щипцов аккуратно соскребите поверхность слизистой. Этот шаг необходим для повышения качества приготовления. Покройте слизистую оболочку свежеприготовленным двухмиллимолярным хелатным буфером ЭДТА.

Затем после промывания ткани на льду, три-четыре раза согласно текстовому протоколу под рассекающим микроскопом, с помощью изогнутых щипцов аккуратно соскабливать слизистую для освобождения кишечных крипт с помощью пипетки. Аккуратно извлеките суспензию крипты из чашки Петри и переложите ее в коническую трубку объемом 50 миллилитров. Затем проверьте ткани, чтобы убедиться, что со слизистой были удалены практически все крипты.

Дважды отфильтруйте суспензию крипты через фильтр 150 микрометров и с помощью микроскопа проверьте протекание через После промывки суспензии крипты и переноса необходимого количества крипты в пятимиллилитровую трубку с круглым дном, согласно текстовому протоколу, центрифугируйте фракцию крипты в течение 10 минут при 150 G и четырех градусах Цельсия. Затем удалите надосадочную жидкость с помощью предварительно охлажденных наконечников для дозатора и матрицы базальной мембраны Resuspend. Крипта дробина.

Нанесите 50 микролитров суспензии крипты в матрице базальной мембраны на лунку на предварительно прогретую пластину, медленно выбрасывая матрицу базальной мембраны в центр лунки. Инкубируйте планшет в инкубаторе с 5% углекислым газом при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут, чтобы обеспечить полную полимеризацию матрицы базальной мембраны. Затем наложите на матрицу базальной мембраны 500 микролитров полной микрокишечной среды человека, дополненной 2,5 микромолярами CHIR 9 0 2 2 1.

И Тьен инкубирует ткань, меняя среду через два дня, а затем через день. На этом рисунке показан типичный пример свежевыделенных крипт из цельной ткани. Количество крипт, выделенных из биопсии, меньше, чем в цельной ткани.

Два биопсийных укуса обычно выполняются за один проход. Результатом каждого биопсийного укуса является поверхность площадью 10 квадратных миллиметров, в среднем от 50 до 100 кристаллов на биопсию. После культивирования и матрикса базальной мембраны в течение пяти-шести дней, Crips округляются, образуя энтеросферы для тонкой кишки и колоносферы для толстой кишки, и проходят через семь дней.

Входы или OID, полученные из показанной здесь биопсии, претерпевают такое же развитие при более низкой плотности при посеве. Поэтому упаковку обычно делают после 10-12 дней в культуре. Как показано здесь, как OID, так и OID имеют просветную сторону и выстланы эпителием.

Пролиферативные клетки могут наблюдаться внутри OID и расположены на кончиках бутонов. Конфокальная визуализация ОИД, окрашенных е-катрином, здесь зеленым цветом показывает эпителиальные клетки. На этом рисунке показаны входы, растущие у пациента с муковисцидозом и хохлатой энтеропатией, вызванной врожденной мутацией в гене молекулы адгезии эпителиальных клеток.

Следуя этой процедуре или методу, такому как ПЦР в реальном времени или западная кровь, можно использовать для ответа на дополнительный вопрос о гене или проблеме, представляющей интерес. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как последовательно изолировать человеческие Crips, чтобы иметь возможность эффективно генерировать входы в вашу лабораторию для ответов на конкретные вопросы вашего пациента.