3D-человека легочной ткани Модель функциональных исследований по Микобактерии туберкулеза Инфекция

Общая цель этой процедуры заключается в построении in vitro модели легочной ткани для изучения инфекции M-tuberculosis. Это достигается путем предварительного наложения коллагеновой матрицы фибробластов на фильтр вставки пластины для клеточной культуры. На втором этапе инфицированные иммунные клетки и эпителиальные клетки легких размещаются на слое коллагена фибробластов.

Полученная 3D-модель ткани затем подвергается воздействию воздуха, чтобы облегчить секрецию слизи и расслоение эпителия. На заключительном этапе ткань собирается и монтируется. В конечном счете, иммунофлуоресцентная микроскопия используется для анализа формирования ранней гранулемы, вызванной M. tuberculosis.

Основным преимуществом данной методики или существующих методов, таких как монослой клеток in vitro, является то, что клетки в этой системе присутствуют в 3D микроокружении, позволяющем формировать гранулемы при заражении вирулентными микробактериями, напоминающими туберкулез человека. Остановите реакцию восемью миллилитрами полного DMEM, а затем раскрутите клетки вниз. Повторно суспендируйте гранулы при концентрации 230 000 клеток на миллилитр в свежем дмм и поместите клетки на лед. Затем добавьте по одной вставке на лунку в шестерку.

Хорошо тарелируйте и выдавите по одному миллилитру свежеприготовленной смеси ячеистого слоя в каждую вставку, следя за тем, чтобы смесь покрывала всю вставку, не оставляя пузырьков воздуха. Затем поместите тарелку в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия на 30 минут. В конце инкубации смешайте два миллилитра коллагена с 615 микролитрами премикса в стерильной конической пробирке на льду для нейтрализации pH коллагена на одну вставку.

Затем добавьте в коллагеновую смесь 58 микролитров полного dmem и 327 микролитров легочных фибробластов на вкладыш. Пипетирование вверх и вниз для равномерного распределения клеток по всей смеси. Теперь быстро добавьте три миллилитра клеточного слоя вниз по боковой стороне каждой вставки на каждый слой бесклеточного коллагена.

Следя за тем, чтобы не было пузырьков воздуха и верните планшет в инкубатор для клеточных культур еще на два часа. После полимеризации коллагена добавьте по два миллилитра полного дмем на дно каждой лунки, и верните тарелку в инкубатор еще на 24 часа. На следующий день с помощью пары чистых щипцов осторожно поднимайте вставки по одному и отсасывайте питательную среду со дна каждого.

Что ж, затем добавьте два миллилитра полного цифрового мультиметра на дно каждой лунки и два миллилитра полного цифрового мультиметра на каждую вставку. Меняя оба объема среды каждый второй день в течение пяти-семи дней. Чтобы получить инфицированные макрофаги, начинают с инкубации культуры макрофагов в течение четырех часов с вирулентным M-tuberculosis при кратности инфекции 10.

В конце инкубации трижды промойте клетки PBS, чтобы удалить внеклеточные бактерии, и обработайте макрофаги двумя миллимолярами, А ДТА в течение 10 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Когда клетки отслоятся, приостановите их в полной ДММ без антибиотиков. Затем аспирируйте всю среду из пластины коллагенового матрикса фибробластов и добавьте 1,5 миллилитра свежего полного ДММ без антибиотиков во внешние камеры.

Затем смешайте флуоресцентно меченые моноциты с инфицированными макрофагами в соотношении пять к одному на 50 микролитров полного DM EM без антибиотиков на одну вставку. Затем добавьте 50 микролитров смеси моноцитарных макрофагов внутрь каждого вкладыша и верните планшет в инкубатор. Через час медленно добавьте два миллилитра культуры, нанесите средний слой на стенки вставок, чтобы избежать смещения клеток, и инкубируйте культуры еще 24 часа.

Чтобы засеять культуры эпителиальными клетками легких, добавьте 4 миллиона эпителиальных клеток на миллилитр в 50 микролитров полного dmm поверх коллагеновых матриц фибробластов иммунных клеток. Инкубируйте клетки в течение двух минут при комнатной температуре, а затем один час при 37 градусах Цельсия. Затем аккуратно добавьте два миллилитра полного ДММ без антибиотиков во вкладыши, как показано выше, и культивируйте клетки еще три дня.

Через пять дней после посева инфицированные макрофаги отсасывают всю питательную среду из планшета и добавляют 1,8 миллилитра полного ДММ без антибиотиков во внешние камеры. Затем на седьмой день 3D-модели тканей в инкубаторе подвергались воздействию воздуха в течение двух дней без добавления среды во вкладыш. После посева.

Полностью извлеките среду из тарелки и смешайте салфетку моделей с 4%-ным паральдегидом в течение 30 минут при комнатной температуре в темноте. Затем с помощью скальпеля отделите мембраны от луночных вставок. Затем с помощью чистого скальпеля аккуратно снимите боковые стороны моделей тканей и разрежьте каждую ткань на четыре примерно равных по размеру квадратных кусочка.

Переложите детали на предметные стекла и дайте им высохнуть в течение пяти минут. Затем с помощью флуоресцентного монтажа, содержащего антивыцветание и dpi, установите салфетки и накройте их покровными стеклами. Оставьте слайды при комнатной температуре в темноте до тех пор, пока они не высохнут, а затем заклейте края чехлового стекла лаком для ногтей.

Когда лак высохнет, погрузите предметные стекла в 70% этанол для переноса из установки BSL 3. Чтобы визуализировать ткани, получите 3D-изображения от 5 до 10 различных полей, охватывающих весь фрагмент ткани с разрешением 512 на 512, при этом Zack покрывает их толщиной не менее 20 микрон с расстоянием от одного до 1,5 микрон между стеками на флуоресцентном конфокальном микроскопе для 3D-количественной оценки клеточных кластеров. Откройте программу для обработки 3D-изображений и загрузите интересующее вас изображение.

Затем с помощью инструмента настройки дисплея настройте каждый канал для изображения, контрастности, яркости и непрозрачности смешивания, чтобы оптимизировать объемный рендеринг и свести к минимуму шумовые помехи. Затем для визуализации поверхности ткани выберите канал красных моноцитов и установите соответствующие пороги с помощью фильтров, чтобы ограничить выбор красных моноцитов или при необходимости исключить фон. Наконец, экспортируйте данные в соответствующую программу для работы с электронными таблицами для дальнейшего анализа.

На седьмой день конфокальная микроскопия после посева инфицированных M-туберкулезом клеток выявляет скопление красных моноцитов в месте инфекции, о чем свидетельствует присутствие зеленых бактерий, имитирующих поражения туберкулеза человека, известные как гранулема 3D. Визуализация обеспечивает гибкость взаимодействия, изучения и количественной оценки нескольких признаков. Например, 3D-изображение на этих изображениях изображает кластер моноцитов на месте эм туберкулеза.

Пространственное расположение кластеров зеленых бактерий и красных моноцитов можно наблюдать с апикальной, ротационной и боковой проекций. Как и ожидалось, в неинфицированных тканях эти кластеры не наблюдались. Количественная оценка размера и количества моноцитов, клеточных кластеров и тканей, инфицированных M. tuberculosis, показала, что размер клеточных кластеров увеличивается, в то время как количество отдельных моноцитов уменьшается по сравнению с моделями неинфицированных тканей.

Потенциальные пользователи этой модели легочной ткани включают изучение роли различных иммунных клеток и тканевого иммунитета при туберкулезе, изучение фенотипов микобактерий и тестирование кандидатов в лекарства, которые убивают микобактерии в гранулеме.