Выделение, характеристика и функциональное обследование сотовый сети десен иммунной
16 февраля 2016 г.
Мы создали методику выделения, фенотипического описания и функционального анализа иммунных клеток из мышиного десны.
Общая цель этого метода заключается в выделении иммунных клеток десны для углубленной характеристики иммунных реакций, связанных с оральным иммунитетом и пародонтитом. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области орального иммунитета, например, какие клеточные факторы участвуют в патогенезе пародонтита. Основные преимущества этого метода заключаются в том, что он позволяет оценить сеть оральных иммунных клеток и выделить достаточное количество жизнеспособных клеток для последующих исследований in vitro.
В качестве первого шага этого протокола начните с установки штифтов для обездвиживания тела мыши и открытия грудной и брюшной полостей для обнажения сердца и внутренних органов. Затем сделайте разрез в полой вене и с помощью 3-миллилитрового шприца, оснащенного иглой 27-го калибра, введите 3 миллилитра PBS через левый желудочек. Когда вся кровь будет смыта, прикрепите голову мыши к диску для препарирования животом вверх.
Затем с помощью ножниц разрежьте каждую спайку губы по направлению к шее, отделяя кожу, покрывающую нижнюю челюсть и область шеи, и обнажая нижележащие ткани и мышцы. Разрежьте между нижними резцами, чтобы отделить обе стороны нижней челюсти. Иммобилизуйте каждую сторону отделенной нижней челюсти иглами 25-го калибра, чтобы получить доступ к полости рта.
После определения нёба с помощью хирургического лезвия No 10 сделайте вертикальные разрезы прямо перед первым моляром и сзади третьего моляра. Затем рассеките ткани в сторону от носовой полости, а также рассеките блоки от нижней челюсти. Затем удалите лишнюю ткань с границы десны и перенесите верхнечелюстной и нижнечелюстной блоки в 50-миллилитровую коническую трубку, содержащую 5 миллилитров коллагеназы и ДНКазы на льду.
Переваривайте ткань в шейкерном инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа, добавляя 50 микролитров 0,5 моляра ЭДТА в течение последних пяти минут. Затем добавьте к тканям 5 миллилитров холодной ДНКазной среды, и аккуратно перемешайте содержимое тюбика, перемешивая его. Затем переложите четыре блока ткани в чашку Петри.
И залейте их 500 микролитрами свежей ДНКазной среды. С помощью скальпеля удалите десну из каждого блока ткани. И переложите все содержимое чашки в ситечко 70 микрон на вершине 50-миллилитровой трубки.
Вымойте чашку Петри и ситечко от 3 до 5 миллилитров свежей среды ДНКазы. А затем с помощью поршня стерильного 3-миллилитрового шприца разомните десневые ткани о сетку ситечка. Промойте фильтр 30-35 миллилерами холодной среды ДНКазы и центрифугируйте фильтрат.
Затем ресуспендируйте нёбо в 1 миллилитр полной среды, и определите количество жизнеспособных клеток. Выделение и обработка иммунных клеток, как только что было продемонстрировано, дает достаточное количество клеток для проведения стимуляции ex-vivo и характеристики паттернов секреции цитокинов десневых клеток как у диких животных, так и у животных, восприимчивых к пародонтиту. Действительно, состав иммунных клеток десны мыши может быть проанализирован, как показано на этих графиках плотности, оценивающих т- и естественные компартменты клеток-киллеров у мышей, чувствительных к пародонтиту с нокаутом LFA.
Используя соответствующие стратегии гейтирования, также можно определить внутриклеточную продукцию цитокинов TCR бета CD4 положительных, TCR бета CD8 положительных и TCR гамма дельта положительных Т, а также NK и врожденных лимфоидных клеток. После освоения клетки могут быть изолированы за три часа для иммуноокрашивания, если техника выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о том, что все шаги должны выполняться эффективно и быстро, удерживая клетки на льду, когда они не подвергаются манипуляциям.
После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как сортировка клеток, чтобы ответить на дополнительные вопросы, связанные с функцией конкретных подмножеств клеток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен метод выделения и характеристики иммунных клеток из десны мыши. Метод направлен на углубление понимания механизмов орального иммунитета и пародонтита.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Иммунология
- Биология полости рта
- Периодонтология
Теоретическая часть
- Понимание иммунных ответов в ротовой полости имеет решающее значение для лечения заболеваний пародонта.
- Иммунные клетки десны играют значительную роль в иммунитете полости рта.
- Существующие методы могут не обеспечивать достаточного количества жизнеспособных клеток для детального анализа.
- Данная методика направлена на устранение этого пробела, позволяя проводить углубленные функциональные исследования.
Цель исследования
- Изолировать иммунные клетки десны для их последующей характеристики.
- Изучить клеточные факторы, участвующие в патогенезе периодонтита.
- Оценить сеть иммунных клеток полости рта.
Используемые методы
- Иммобилизация мыши и обнажение внутренних органов.
- Разрез полой вены для промывания крови.
- Использование шприца для перфузии PBS через левый желудочек.
- Подготовка мыши к дальнейшему анализу.
Основные результаты
- Успешное выделение жизнеспособных иммунных клеток десны.
- Характеристика иммунных ответов, связанных со здоровьем полости рта.
- Представления о патогенезе периодонтита.
- Потенциал для последующих исследований in-vitro.
Выводы
- Этот метод представляет собой ценный инструмент для изучения иммунитета полости рта.
- Он позволяет лучше понять динамику иммунных клеток в тканях десны.
- Будущие исследования могут использовать данный метод для более глубокого изучения заболеваний пародонта.
Часто задаваемые вопросы
Значимость для промышленности
Точное выделение и функциональный профилинг иммунных клеток десны позволяют снизить механические риски в оральной иммунологии и способствуют валидации мишеней для исследований воспалительных заболеваний. Данный рабочий процесс позволяет получать популяции клеток с высокой жизнеспособностью для количественного фенотипирования и функциональных анализов ex vivo, что повышает прогностическую достоверность на ранних этапах поиска и в трансляционных исследованиях. Этот подход предназначен для принятия решений по портфелю исследований и разработок в области иммунологии и здоровья полости рта, обеспечивая возможность надежного изучения резидентных иммунных сетей тканей.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет исследовать субпопуляции иммунных клеток, участвующих в патогенезе воспаления полости рта.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишеней с помощью анализов секреции цитокинов ex vivo.
- Способствует снижению механистических рисков за счет уточнения вклада иммунных клеток в модели заболевания.
- Предоставляет количественные данные для приоритизации портфеля разработок на основе гипотез.
Скрининг и разработка анализа
- Обеспечивает получение жизнеспособных, фенотипически охарактеризованных иммунных клеток для последующей разработки анализов.
- Поддерживает воспроизводимую подготовку биологических образцов для стандартизированных рабочих процессов скрининга.
- Позволяет получать количественные показатели иммунной функции для оценки соединений.
- Повышает масштабируемость и готовность анализов для платформ высококонтентного скрининга.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет профилирование иммунных клеток с релевантными моделями заболеваний полости рта для обеспечения трансляционной преемственности.
- Обеспечивает поиск функциональных биомаркеров в доклинических исследованиях иммунопатологии полости рта.
- Поддерживает обоснованное с учетом рисков развитие иммуномодулирующих стратегий, направленных на ткани полости рта.
- Предоставляет понимание механизмов для информированного отбора доклинических кандидатов.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод встраивается в континуум от этапа открытия до доклинических исследований, обеспечивая получение высококачественных препаратов иммунных клеток как для механистических исследований, так и для функционального скрининга в моделях заболеваний полости рта.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез о роли иммунных клеток в гомеостазе и патологии тканей полости рта.
- Скрининг: обеспечивает получение воспроизводимых жизнеспособных популяций клеток для разработки методов анализа и тестирования соединений.
- Аналитика: позволяет проводить количественное измерение секреции цитокинов и фенотипов иммунных клеток для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: позволяет связать результаты фундаментальных исследований с доклинической валидацией на релевантных моделях заболеваний полости рта.
- Корпоративное повторное использование: устанавливает стандартизированный рабочий процесс, адаптируемый к различным программам исследований в области иммунологии полости рта.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность в исследованиях иммунитета полости рта.
- Операционная ценность: обеспечивает стандартизированную, воспроизводимую и масштабируемую изоляцию иммунных клеток для обеспечения сопоставимости результатов различных исследований.
- Стратегическая ценность: способствует принятию обоснованных решений о продолжении или прекращении разработок (go/no-go) и капиталоэффективному продвижению активов в области оральной иммунологии.
- Влияние на портфель: позволяет осуществлять приоритезацию мишеней и подходов в пайплайнах оральной и слизистой иммунологии с учетом рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в препарировании мышей и работе с иммунными клетками.
- Необходим доступ к оборудованию для проточной цитометрии и инфраструктуре для проведения функциональных анализов ex vivo.
- Необходима стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости выделения и анализа клеток.
- Адаптация метода для других слизистых тканей может потребовать оптимизации протокола.
- Жизнеспособность и выход клеток зависят от соблюдения временных интервалов и температурного режима при выполнении процедур.
