Определение фоторецепторных клеток спектральной чувствительности в насекомых модель от

Общая цель данного метода внутриклеточной регистрации заключается в определении спектральной чувствительности отдельных фоторецепторных клеток в сложном глазу насекомого in vivo. Этот метод позволяет установить, влияют ли фильтрующие пигменты на длину волн света, к которым чувствительна клетка. Основным преимуществом данной методики является то, что, зная спектральную чувствительность отдельных фоторецепторов, мы можем предсказать диапазон цветов, который видит животное.

Для подготовки к записи включите ксеноновую лампу минимум за 45 минут до начала эксперимента, а микроэлектродный пуллер — как минимум за 30 минут до вытягивания стеклянных электродов. Затем включите всё записывающее оборудование. Убедитесь, что затвор закрыт по умолчанию, чтобы свет не проходил через оптоволоконный кабель.

Затем с помощью пуллера для микроэлектродов вытяните тонкие боросиликатные стеклянные микроэлектроды. Заполните электроды 3 M раствором хлорида калия. Для подготовки образца под микроскопом закрепите отдельную бабочку внутри небольшой пластиковой трубки с помощью горячего воска так, чтобы голова была неподвижна и выступала из одного конца трубки.

Затем зафиксируйте хоботок, усики и крылья с помощью воска. После этого прижмите брюшко сухим кусочком воска. Поддерживайте влажность в пробирке, поместив внутрь неё, за брюшком экземпляра, влажную салфетку.

Убедитесь, что образец полностью неподвижен. Затем закрепите пробирку с помощью небольшого кусочка воска на малой платформе с шаровым шарниром, которая прикреплена к магнитному основанию. Под стереомикроскопом введите серебряную проволоку в голову через ротовое отверстие в качестве электрода сравнения.

Перед началом эксперимента надежно закрепите провод на платформе. Затем с помощью лезвия бритвы прорежьте небольшое отверстие в левой роговице и закройте его вазелином для предотвращения высыхания. После прорезания роговицы как можно быстрее введите записывающий электрод в глаз, так как гемолимфа в глазу быстро затвердевает, что сделает введение электрода невозможным.

По возможности проводите диссекцию в той же установке, в которой будет осуществляться запись. Затем с помощью зажимов-«крокодилов» подключите заземляющий провод головного усилителя к референсному электроду на платформе с образцом. Установите электрод в держатель для электродов.

Затем вставьте серебряную проволоку в раствор хлорида калия в микроэлектроде. Используйте источник света с гибкими креплениями («гусиная шея») для освещения образца под стереомикроскопом при погружении электрода в глаз. Отрегулируйте держатель электрода так, чтобы микроэлектрод находился точно над ранее проделанным отверстием в роговице.

Затем с помощью микроманипулятора опустите микроэлектрод в глаз до замыкания цепи. После того как электрод окажется в глазу, выведите стереомикроскоп за пределы клетки Фарадея. Выключите источник света, освещающий образец, и оставьте насекомое в темноте на 10–20 минут для темновой адаптации.

Проверьте сопротивление электрода, подав ток силой 1 нА и зафиксировав изменение напряжения. Сопротивление обычно должно находиться в диапазоне от 100 до 250 МОм. Затем включите генератор импульсов для подачи вспышки света на протяжении всего эксперимента и направьте оптоволоконный кабель к глазу.

Следите за изменением напряжения на осциллографе при каждой вспышке света. Отрицательное изменение напряжения означает, что электрод еще не вошел в клетку. Перемещайте оптоволоконный кабель вокруг образца до тех пор, пока не будет достигнут максимальный вольт-ответ.

Для получения деполяризующего светового ответа перемещайте микроманипулятор вперед и назад, вызывая небольшие вертикальные смещения электрода, одновременно слегка постукивая по основанию держателя электрода или используя функцию buzz на предусилителе. Продолжайте вносить небольшие корректировки до тех пор, пока на осциллографе не появится деполяризующий световой ответ. Затем отрегулируйте положение оптоволоконного кабеля, чтобы найти максимально выраженный деполяризующий сигнал.

С помощью микроманипулятора внесите небольшие коррективы и, при необходимости, используйте функцию вибрации («buzz») на усилителе, чтобы убедиться, что электрод стабильно регистрирует активность клетки. Стабильная запись характеризуется минимальным или отсутствием изменений потенциала покоя, низким уровнем фонового шума и устойчивым выраженным деполяризационным ответом. Крайне важно добиться стабильной регистрации, при которой потенциал покоя мембраны не зашумлен и не изменяется с течением времени.

Ответы должны быть амплитудными и положительными, без гиперполяризации. Как только установка стабилизируется, запустите программное обеспечение и закройте диалоговое окно «Experiments Gallery», чтобы открыть всплывающее окно с четырьмя каналами. Установите масштаб напряжения в верхнем правом углу окна программы на 500 millivolts.

Затем нажмите «Start» в правом нижнем углу, чтобы начать запись. Сверните окна третьего и четвертого каналов и настройте масштаб по осям X и Y. После этого оставьте программу работать на протяжении всего эксперимента.

Для стимуляции белым светом зарегистрируйте до 10 индивидуальных ответов, установив колесо ND-фильтров на максимальное значение OD, при котором все еще вызывается ответ. Здесь изменение ответа показано при 3,0 OD и 2,0 OD. Затем зарегистрируйте такое же количество ответов в диапазоне от 3,5 до 0,0 OD при каждой комбинации, чтобы построить кривую зависимости интенсивности ответа. Перед регистрацией ответа клетки на все длины волн с использованием интерференционных фильтров сначала быстро определите пиковую длину волны.

При отсутствии ND-фильтра на пути светового луча установите УФ-пропускающий фильтр и кратко зафиксируйте амплитуду отклика. Повторите процедуру с синим, зеленым и красным пропускающими фильтрами, что позволит примерно определить положение пика отклика. Перед переходом к другому интерференционному фильтру запишите длину волны фильтра, при которой наблюдается максимальный отклик.

Между записями с использованием последовательных фильтров дайте клетке ответить на одну или две вспышки белого света без какого-либо фильтра на пути луча, чтобы отслеживать, не снижается ли пиковый ответ с течением времени. Затем проводите запись с другими интерференционными фильтрами, допуская до 10 ответов на один фильтр. Это пример значительного отрицательного изменения напряжения, которое наблюдается непосредственно перед входом в клетку.

Здесь представлена чистая запись с низким уровнем фонового шума и выраженным деполяризационным ответом, который обычно составляет не менее 40 millivolts. А здесь приведен пример плохой записи из-за отрицательного изменения потенциала после основного пика. Это еще один пример неудачной записи.

Потенциал покоя подвержен значительным колебаниям, и высокий уровень фонового шума может маскировать амплитуду отклика. Это типичный пример спектральной чувствительности, полученной на основе одной записи. Типы клеток классифицируются по пику чувствительности на схожей длине волны и общей форме спектра чувствительности.

Затем данные по одинаковым типам клеток усредняются, и на графике отображается средняя чувствительность со стандартными ошибками для каждой длины волны. На этом графике представлены спектры чувствительности трех типичных типов клеток, встречающихся у насекомых. После освоения эта методика может быть выполнена примерно за два часа.

После выполнения данной процедуры можно провести поведенческие эксперименты, чтобы определить, участвуют ли все типы фоторецепторных клеток в цветовом различении.