Высокая пропускная способность CRISPR Конструирование вектора и характеристика ДНК Модификации генерацией Томатный волосистых корней

Общая цель этой процедуры клонирования и трансформации заключается в эффективном создании векторов CRISPR и выбивании мутантных корней томатов, которые могут быть использованы в функциональных геномных исследованиях. Этот метод является полезным инструментом в области геномики растений, поскольку он может генерировать большое количество нокаутных мутантов, которые могут быть использованы в различных корневых процессах. Основное преимущество этого метода заключается в том, что процедура клонирования может быть выполнена за один шаг, что позволяет получить групповые материалы всего за несколько недель.

Во-первых, руководство по проектированию РНК или олигонолигонов гРНК должно включать в себя часть GN19 мотивов-мишеней, окруженную пятью простыми и тремя простыми 20-нуклеотидными последовательностями, необходимыми для сборки ДНК. Расщепите от одного до пяти микрограммов плазмиды казнина P201N с ферментом рестрикции Spe1 при 37 градусах Цельсия в течение двух часов. После очистки колонки дигест в соответствии с инструкциями производителя повторно суспендировать в 15 микролитрах 10 миллимоляров Trs HCL.

Количественное определение количества ДНК с помощью УФ-спектрофотометрии. Проведите второй дижествент с ферментом рестрикции Swa1 при температуре 25 градусов Цельсия в течение двух часов. Проверьте от 100 до 200 нанограммов на геле с нулевым содержанием восьми десятых восьми процентов агарозы, чтобы подтвердить полное пищеварение.

Правильно переваренная плазмида будет иметь одну полосу с 14 313 парами оснований. Для ПЦР-амплификации medicago truncatula используют шесть промоторных и каркасных ДНК из челночной плазмиды гРНК шайбы. Используйте праймерные капсюли Swa1 и Mtu6F и MTU6R, а также скаффолд F в скаффолде Spe1 R в полимеразе высокой точности.

Визуализируйте три микролитра аликатов продуктов ПЦР на однопроцентном агарозном геле для подтверждения амплификации. Ампликон MTU6 состоит из 377 пар оснований, а ампликон каркаса — из 106 пар оснований. В колонке очистите оставшиеся продукты ПЦР в соответствии с инструкциями производителя.

Количественно оценивайте с помощью УФ-спектрофотометрии, как и раньше, и храните при температуре минус 20 градусов Цельсия. Затем повторно суспендируйте всю пробирку олигонотидов гРНК до 100 микромоляров в лабораторной воде. Добавьте один микролитр олиго к 500 микролитрам 1xNEB буфера две целые одну и хорошо перемешайте.

Запрограммируйте термоамплификатор с нагретой крышкой на удержание при температуре 50 градусов Цельсия. Соедините 100 нанограмм линеаризованного вектора, 50 нанограммов промотора MtU6, 12 нанограммов Scaffold и один микролитр разведенного олиго гРНК в воде до конечного объема в пять микролитров. Добавьте пять микролитров 2X высококачественной сборки ДНК Mastermix.

Хорошо перемешайте и убавьте обороты. Инкубируйте реакцию в течение 60 минут в термоамплификаторе с температурой 50 градусов Цельсия. После часа при температуре 50 градусов Цельсия поместите реакцию на лед, а затем используйте два микролитра для трансформации компетентных клеток E.Coli с использованием стандартных методов.

Положите преобразующий препарат на LB Агар с добавлением 50 миллиграммов на миллилитр канамицина и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. Скрининг колоний с помощью ПЦР с праймером StUb3p 218R и 1Sce1R. Разбавьте алекат оставшейся реакции сборки ДНК водой в соотношении 1:5 и используйте один микролитр в качестве положительного контроля для скрининга колонии.

Также включите один нанограмм круглого плазмида P201N каснина в качестве контроля без вставки. После амплификации ПЦР с использованием параметров, содержащихся в письменной части протокола, визуализируйте продукт ПЦР на однопроцентном агарозном геле. Правильные вставки имеют полосу 725 пар оснований, а векторы без вставок будут иметь полосу 310 пар оснований.

Выращивайте положительные колонии в жидких культурах LB Can50 в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. На следующий день очистите плазмиды с помощью набора для очистки плазмид в соответствии с инструкциями производителя. После секвенирования очищенных плазмид по методу Сэнгера с помощью праймера StuB3P218R выровняйте хроматограммы по промотору MtU6, Target и последовательностям скаффолда, чтобы убедиться в отсутствии ошибок во время клонирования.

Проведите диагностическое расщепление, расщепляя один микрограмм плазмиды с EcoR5 и Sti1. При визуализации на агарозном геле с нулевым значением восемь целых следует заметить этот узор полос. Наконец, трансформируйте плазмиды в штамм Agrobacterium rhizogenes ARqua1, добавив один микролитр плазмидного препарата к 50 микролитрам электрокомпетентных клеток и электропорируя в кювете с одним миллилимитером.

Добавьте примерно 500 микролитров среды SOC и встряхивайте при температуре 28 градусов Цельсия в течение двух часов. Затем пластину на LB Can50 пластины и выращиваем при температуре 28 градусов Цельсия в течение двух дней. Начните этот раздел процедуры со стерилизации семян томатов в 20-процентной бытовой хлорной извести в течение 15 минут при постоянном перемешивании.

Затем переложите семена в ламинарный проточный колпак. Удалите отбеливатель и трижды постирайте в стерильной лабораторной воде. Поместите 30 семян в коробку GA7, содержащую половину MS Media.

Дайте прорасти около двух дней в темноте. После того, как семена прорастут, переместите коробки GA7 на свет. За день до трансформации рассейте культуры A.rhizogenes на твердом LB, содержащем Can50, и выращивайте при температуре 28 градусов Цельсия в течение ночи. В день трансформации проработайте в ламинарном проточном колпаке добавить 25 микролитров Ацетосирингона на 50 миллилитров одной половины МС и влить по шесть миллилитров в каждую культуральную пробирку.

С помощью изогнутого наконечника объемом 200 микролитров соскребите клетки A.rhizogenes с пластины и повторно суспендируйте в шести миллилитрах половины жидкости MS. Сделайте вихревую трубку для полного ресуспендирования клеток. После ресуспензии клеток от каждого вектора возьмите один миллилитр клеток и измерьте оптическую плотность на фиксированной длине волны 600 нанометров.

Добавьте два миллилитра половины жидкости МС в чашку Петри со стерильной фильтровальной бумагой. Вырезаем семядоли из рассады и помещаем на увлажненную фильтровальную бумагу. После того, как все семядоли будут собраны, отрежьте от семядолей самый дальний сантиметр на один сантиметр, в результате чего получаются кусочки семядолей с двумя срезанными концами.

Добавьте взрывозащищенные растения в растворы A.rhizogenes и перемешайте. Инкубировать в течение 20 минут с периодическим инвертированием. Во время инкубации A.rhizogenes добавьте лист фильтровальной бумаги в чашку Петри для каждого преобразования конструкции.

Кроме того, установите одну половину твердой среды MS без антибиотиков в ламинарный колпак для высыхания. С помощью стерильных щипцов вычерпните семядоли из раствора A.rhizogenes и положите их на сухую фильтровальную бумагу. Накройте крышкой чашки Петри, чтобы ткани не пересохли, пока вы приступаете к следующему преображению.

Затем промокните семядоли на фильтровальной бумаге и перенесите абаксиальную сторону до половины MS среды. Оберните пластины хирургическим скотчем и совместно обрабатывайте в темноте при комнатной температуре в течение двух суток. После совместного культивирования перенесите семядоли абаксиальной стороной вверх в добавленную половину среды MS.

Оберните хирургическим скотчем. Выдерживайте культуры под люминесцентными лампами при комнатной температуре с 16-часовым периодом фотосъемки. Через пять-две недели с помощью стерильных щипцов и скальпеля удалите корни длиной не менее двух сантиметров от семядолей и переведите их на тикарциллон/клавуланатную кислоту и канамицин, дополненные половиной среды рассеянного склероза.

Переложите от десяти до 15 корней на одну пластину. Отметьте маркером положение кончиков корней. Оберните хирургической лентой и сохраните в помещении для культивирования.

Через неделю на селективных средах наблюдаются растущие корни трансформации. Соберите подобразец трансформированных корней для экстракции ДНК с использованием предпочтительного метода экстракции ДНК. Волосатые корни можно увидеть появляющимися из семядолей через 11 дней после трансформации.

Корни отбирают на основе тикарциллона/клавуланатной кислоты и канамицина, дополненных половиной MS Media, в течение примерно одной недели. Серые полосы обозначают положение кончиков корней в момент нанесения покрытия. Это пример клонирования и секвенирования продуктов ПЦР для определения мутаций ДНК с двумя разными генами-мишенями в четырех различных событиях волосатого корня.

Серым прямоугольником обозначена последовательность-мишень GN20 GG, а дельта указывает на тип мутации. Количество клонов с указанной мутацией показано справа. Это пример полиакриламидного геля для определения мутаций ДНК.

Большие делеции и гетердуплексные полосы указывают на наличие мутаций ДНК в целевых последовательностях. Шесть из 12 независимых соревнований были оценены как мутанты, как указано символом дельты. WT указывает элемент управления типа wild, а NT — элемент управления без шаблона.

После освоения можно получить от десятков до сотен векторов CRISPR за одну неделю, а материалы трендулятных групп могут быть получены в течение нескольких недель. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно удалить и подавить рост любых остаточных агробактерий. Чрезмерный рост агробактерий подавит и убьет любой корневой материал.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как генерировать векторы CRISPR с помощью сборки ДНК и как протестировать эти векторы с помощью модели волосатого корня и помидора.