Иммобилизация Multi-биокатализаторов в альгинатные гранулы для регенерации кофактора и улучшены возможности повторного использования

Общая цель этой экспериментальной процедуры состоит в том, чтобы продемонстрировать использование связанной биокаталитической системы целых клеток, иммобилизованной в альгинатных гранулах, для повышения производительности и возможности повторного использования. Это моя тема, я ответил на ключевые вопросы в области биокатализа, такие как иммобилизация биокатализаторов, стабильность, регенерация кофакторов и цельноклеточные биокатализаторы. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он обеспечивает простой, но гибкий подход к улучшению производства многих важных биомолекул по кофакторно-зависимым путям.

В этом протоколе используются два рекомбинантных штамма E. coli. SpNOx E coli, который экспрессирует NADH оксидазу, и HjLAD E coli, который экспрессирует L-арабинитолдегидрогеназу. Поскольку эта процедура одинакова для обоих штаммов E. coli, она будет продемонстрирована только для HjLAD E. coli.

Инокулируйте одну колонию HjLAD E. coli в три миллилитра среды LB, добавив 15 микрограммов на миллилитр Ket-A-My-Sin, и инкубируйте в течение ночи в шейкере инкубатора. На следующий день разбавьте культуру в соотношении 1:100 в 200 миллилитрах свежего LB, содержащем 15 микрограммов на миллилитр Ket-A-My-Sin, и инкубируйте при 37 градусах Цельсия при 250 оборотах в минуту до тех пор, пока OD 600 не достигнет примерно 0,6. Индуцируйте экспрессию белка HjLAD путем добавления 0,1 миллимоляра IPTG в культуральную среду и инкубации при температуре 25 градусов Цельсия, 200 об/мин, в течение шести часов.

Соберите индуцированные клетки путем центрифугирования при температуре 3200 G и четырех градусах Цельсия в течение 20 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и приступайте к обработке клеточной гранулы, как показано в следующем сегменте. Чтобы начать эту процедуру, мы суспендируем клеточные гранулы HjLAD E coli и SpNox E coli отдельно в 50 миллимолярах буфера Tris-Hcl, при плотности клеток пять граммов сухой клеточной массы на литр.

В пробирке с круглым дном объемом 14 миллилитров смешайте 600 микролитров пяти граммов сухой клеточной массы на литр HjLAD E-палочки, 600 микролитров пяти граммов сухой клеточной массы на литр SpNOx E coli, 100 микролитров 20 миллимолярных NAD plus и 150 микролитров двухмолярного L-арибинита. Доведите объем реакции до двух миллилитров, добавив 550 микролитров 50 миллимолярного Tris-HCl. Инкубируйте реакционную смесь при температуре 30 градусов Цельсия и 200 об/мин в течение восьми часов.

Через восемь часов центрифугируйте смесь при температуре 3200 G и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут и соберите надосадочную жидкость реакции. Чтобы количественно оценить продукцию L-ксилолы с помощью колориметрического анализа, отсадите 100 микролитров собранной надосадочной жидкости в пробирку объемом 1,5 миллиметра. Добавьте 50 микролитров 1,5% цистеина, 900 микролитров 70% серной кислоты и 50 микролитров растворенного в этаноле 0,1% Kar-Piz-All и аккуратно перемешайте, трижды перевернув трубку.

Инкубируйте реакционную смесь при температуре 37 градусов Цельсия и 200 об/мин в течение 20 минут. Измерьте оптическое поглощение реакционной смеси на 560 нанометрах с помощью спектрофотометра. Начните протокол иммобилизации с приготовления 4%-ного раствора альгината.

Добавьте 0,8 грамма альгината натрия в 20 миллилитров дистиллированной воды, и нагрейте смесь, чтобы растворить альгинат натрия. Добавьте 600 микролитров веса пяти граммов сухих клеток на литр HjLAD E. coli и 600 микролитров веса пяти граммов сухих клеток на литр SpNOx E. coli к 1,2 миллилитрам 4%-ного раствора альгината. Смешайте клетки и альгинат с помощью аккуратного пипетирования, чтобы избежать образования пузырьков.

Чтобы обеспечить образование альгинатных гранул с одинаковым размером, морфологией и жесткостью, крайне важно медленно, по каплям добавлять суспензию альгината клеток на оптимальное расстояние в достаточный объем раствора хлорида кальция, чтобы покрыть все гранулы. Аспирируйте суспензию альгинатных клеток в шприц с помощью иглы, затем добавьте смесь по каплям в 0,3 молярного раствора хлорида кальция в стакане объемом 100 миллилитров при непрерывном помешивании. Оставьте шарики в растворе хлорида кальция на два-три часа при комнатной температуре, не перемешивая, чтобы произошло сшивывание.

Сцедите раствор хлорида кальция, не потревожив шарики, осторожно налив раствор хлорида кальция в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Переложите оставшиеся бусины в еще одну коническую трубку объемом 50 миллилитров. Чтобы удалить избыток хлорида кальция и неинкапсулированные клетки, промойте шарики 50 миллимолярным буфером Tris-HCl.

Добавьте в бусины 10 миллилитров буфера и дайте суспензии постоять в течение трех-пяти минут. Как только бусины осядут на дно, сцедите буфер в другую емкость. Таким образом вымойте бусины три раза.

Не центрифугируйте шарики ни на одном этапе, иначе они разорвутся. Не выбрасывайте использованный буфер для стирки Tris-HCl. Вытяните 30 миллилитров использованного буфера для промывки с использованным раствором хлорида кальция, собранным ранее.

Гранулируйте неиммобилизованные клетки E. coli путем центрифугирования вытянутого раствора хлорида кальция и Tris-HCl в 3200 раз больше G в течение 20 минут. Переложите промытые бусины в трубочку. Затем оцените биосинтез L-ксиллозы в соответствии с процедурой, продемонстрированной для клеточных гранул, но с использованием всех промытых гранул вместо клеточных гранул.

Чтобы оценить стабильность иммобилизованных биокатализаторов для производства L-ксилулозы, соберите гранулы после их формирования. И дважды промыть 10 миллилитров 50 миллимолярного буфера Tris-HCl без центрифугирования, как показано ранее. Используйте все промытые шарики для проведения реакции производства L-ксилулозы, как было показано ранее.

Количественно оцените продукцию L-ксилулозы с помощью колориметрического анализа, также как было показано ранее. Повторяйте реакцию производства L-ксилозы в течение желаемого количества производственных циклов и измеряйте количество L-ксиллозы, образующейся в надосадочной жидкости реакции в каждом цикле. Производство L-ксилулозы усиливается этой связанной биокаталитической системой целых клеток.

Начиная с начальной концентрации 150 миллимоляров L-арибинита, использование только биокатализатора HjLAD E. coli дало выход 79% L-ксилулозы. Для сравнения, использование клеток HjLAD E coli и SpNOx E coli в соотношении один к одному дало выход 96% L-ксилулозы. Оценка параметров, влияющих на эффективность иммобилизации биокатализатора, показала, что эффективность увеличивается с увеличением концентрации альгината натрия в диапазоне от одного до трех процентов.

Однако концентрация альгината натрия выше 2% приводит к снижению выхода L-ксилулозы. При использовании концентрации альгината натрия 2% оптимальная концентрация хлорида кальция для иммобилизации и выхода L-ксиллозы была определена как 0,3 моляра. Оценивалась возможность повторного использования биокатализаторов.

На этом графике производство L-ксилулозы в течение семи последовательных циклов повторного использования иммобилизованных и свободно связанных цельных биокатализаторов показано темно-серым и светло-серым цветами соответственно. Несмотря на то, что максимальный выход L-ксиллозы при использовании иммобилизованных цельноклеточных биокатализаторов ниже, чем при использовании системы со свободно связанными целыми клетками, возможность повторного использования улучшается за счет иммобилизации. В конце семи циклов последовательного повторного использования иммобилизованные биокатализаторы сохранили свою стабильность и сохранили 65% от исходного выхода L-ксилулозы.

После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биокатализа к изучению выходов полноценных многоклеточных биокатализаторов и основных реакций, в которых участвуют кофакторы.