Одновременная оценка кардиомиоцитов синтеза ДНК и плоидности: метод для оказания помощи квантификации кардиомиоцитов регенерации и оборота

Общая цель данного протокола заключается в количественной оценке обновления кардиомиоцитов с помощью длительного маркирования нуклеозидами и проточной цитометрии для определения количества ядер новых кардиомиоцитов с учетом полиплоидизации ядер. Этот метод может быть использован для решения ключевых вопросов в области регенерации кардиомиоцитов, а также в качестве инструмента скрининга для количественной оценки изменений в динамике образования кардиомиоцитов. Главным преимуществом данного протокола является возможность высокочувствительного и точного количественного определения генерации новых кардиомиоцитов независимо от клеточного источника и с контролем полиплоидизации.

Через 24 часа после шестой инъекции EdU положите подопытное животное в положение на спине и с помощью хирургических ножниц сделайте разрез кожи от середины брюшной полости до диафрагмы. Затем, раздвинув грудину в стороны от брюшной полости, рассеките диафрагму, чтобы обнажить сердце. После этого слегка приподнимите сердце и перережьте основные кровеносные сосуды выносящего тракта, чтобы извлечь сердце из грудной полости.

Сразу после извлечения поместите сердца в отдельные центрифужные пробирки объемом 15 mL, содержащие 10 mL PBS, охлажденного до четырех градусов Цельсия. Затем перенесите образцы в отдельные чашки Петри диаметром 10 cm и с помощью скальпеля разрежьте каждое сердце на две части в сагиттальной плоскости. После этого осторожно сожмите кусочки сердца пинцетом.

Извлеките оба фрагмента сердца и поместите их в чашку Петри, содержащую 20 mL свежего PBS. Повторите процедуру еще раз, используя новую чашку Петри и 20 mL свежего PBS. Поместите обе части сердец в одну микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 mL и с помощью иглы 25-го калибра сделайте небольшое отверстие в крышке каждой пробирки, чтобы предотвратить ее открытие после обработки сердца.

Затем промаркируйте каждую пробирку и заморозьте ткани сердца в контейнере с жидким азотом. Для каждого сердца, подлежащего анализу, поместите в центрифужную пробирку 36 mL 1% BSA и PBS для инкубации. Слейте раствор через 30 минут.

После того как пробирки высохнут на воздухе, добавьте в каждую из них 10 mL раствора для градиента сахарозы. После индивидуального измельчения образцов сердца, замороженных в жидком азоте, с помощью скальпеля перенесите фрагменты ткани каждого сердца в отдельные конические пробирки объемом 50 mL, содержащие 15 mL буфера для лизиса клеток. Гомогенизируйте образцы в течение 15 секунд при 25 000 rpm с помощью гомогенизатора с погружным зондом при комнатной температуре.

Затем добавьте в каждую пробирку еще 15 mL лизирующего буфера и поочередно перенесите образцы в гомогенизатор Dounce объемом 40 mL с пестиком с большим зазором. Выполните 10 движений пестиком и профильтруйте клеточные суспензии через сито с размером пор 100 микрон, а затем через клеточный фильтр 40 микрон в отдельные центрифужные пробирки объемом 50 mL. Затем центрифугируйте образцы для сбора ядерных сердечных осадков и ресуспендируйте клетки в 25 mL раствора сахарозного градиента для каждого образца.

Нанесите клетки поверх градиента сахарозы, не содержащего ядер, в подготовленные ультрацентрифужные пробирки и центрифугируйте слои с использованием ротора с поворотными стаканами. После центрифугирования ресуспендируйте осадки ядер в 1 300 мкл буфера для хранения ядер и перенесите ядра в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл с маркировкой PCM1. Перенесите по 300 мкл каждой суспензии из пробирок PCM1 в новую микроцентрифужную пробирку, добавьте 700 мкл свежего буфера для хранения ядер и промаркируйте как ISO-контроль.

Затем проведите маркировку ядер PCM1 антителами к PCM1, а контрольных ядер ISO — антителами для быстрого изотипического контроля IGG в течение ночи при температуре four degrees Celsius. На следующий день центрифугируйте образцы и ресуспендируйте осадки в 1 mL свежего буфера для хранения ядер для повторного центрифугирования при тех же условиях. После второго центрифугирования ресуспендируйте осадки в 1 mL свежего буфера для хранения ядер и инкубируйте ядра с 1 µL конъюгированного с fitzy фрагмента F(ab'2 антител козьих к кроличьим IGG в течение одного часа при температуре four degrees Celsius в темноте.

Для оценки степени включения EdU центрифугируйте суспензии ядер, меченных PCM1 и ISO-контролем, и дважды перевзвесьте осадки в 1 мл 1% BSA PBS для проведения двух последовательных промывок. После второй промывки замените супернатант 100 мкл фиксатора EdU и инкубируйте образцы в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. По окончании фиксации промойте ядра еще два раза в 1 мл PBS BSA, затем инкубируйте образцы с 100 мкл раствора для пермеабилизации на основе сапонина при комнатной температуре.

Через 15 минут добавьте в каждую пробирку 500 µL свежеприготовленного коктейля для маркирования EdU и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре. По окончании инкубации трижды центрифугируйте образцы, промывая ядра в 1 mL PBS BSA во время второй и третьей центрифугаций. В завершение маркируйте образцы, добавив 400 µL раствора для окрашивания ДНК.

Иммуногистологический анализ пульсирующих сердец демонстрирует наличие экспрессирующих PCM1 кардиомиоцитов, которые включили EdU. Однако данные, полученные иммуногистологическими методами, могут быть интерпретированы неверно, так как другие типы клеток, включившие EdU, могут быть ошибочно приняты за кардиомиоциты. В исследовании мышей mdx и контрольных мышей анализ методом проточной цитометрии, подробно описанный в данном протоколе, позволяет быстро количественно оценить генерацию ядер новых кардиомиоцитов, исключая при этом клетки, включившие EdU вследствие деполиплоидизации.

Аналогично ранее опубликованным данным, в данном репрезентативном эксперименте наблюдалось увеличение скорости образования ядер новых кардиомиоцитов в сердцах мышей mdx по сравнению с контрольной группой соответствующего возраста. После освоения этой методики ее выполнение занимает четыре часа в течение двух дней. При проведении данной процедуры важно помнить об отрицательных контролях по EdU и PCM1, чтобы при анализе можно было точно установить границы гейтов.

Данный метод также совместим с рядом дополнительных последующих иммуногистологических методов, позволяющих количественно определить включение нуклеоцитов в нескольких различных типах клеток сердца. Этот метод применялся в области сердечно-сосудистых исследований для изучения изменений регенерации кардиомиоцитов на модели mdx неишемической кардиомиопатии. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как быстро количественно оценить ядра неокардиомиоцитов, а также проводить подсчет полиплоидизации для выявления изменений в регенерации и обновлении кардиомиоцитов.