Зазеркалье: Покадровый Микроскопия и Продольная Отслеживание отдельных клеток для изучения анти-терапии рака
14 мая 2016 г.
Здесь мы описываем метод долгосрочной покадровой микроскопии для продольного отслеживания отдельных клеток в ответ на противораковую терапию.
Общая цель этой процедуры заключается в наблюдении за противораковым терапевтическим ответом в отдельных клетках в культуре. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области исследований рака, включая гетерогенный терапевтический ответ и судьбу клеток. Для начала в сертифицированном стерильном ламинарном колпаке подготовьте клетки HT1080 в сертифицированных для культивирования чашках в соответствии с текстовым протоколом и инкубируйте клетки в инкубаторе для увлажненных клеточных культур.
За два дня до визуализации нанесите 50 000 клеток HT1080 FuGENE на лунку в желаемое количество лунок 12-луночной чашки со стеклянным дном No 1,5. Отрегулируйте количество пластинчатых клеток в зависимости от скорости их роста и используемой чашки, чтобы достичь примерно 60% слияния к началу эксперимента.
Установите в камере влажности около 80% и температуру в месте расположения образца на уровне 37 градусов Цельсия. Убедитесь, что резервуар для воды наполнен стерильной дистиллированной водой в соответствии с инструкциями производителя. Затем включите климатическую камеру на нужную температуру, установите ее в предметный столик микроскопа и установите.
Если между верхней камерой сцены и вставкой сцены есть свободное пространство, положите куски парафиновой пленки по краям отверстия для вставки на сцену, прежде чем вставлять в него камеру, чтобы соединить камеру со сценой. Убедитесь, что в камере не натягиваются соединения, которые могут привести к возникновению артефактов движения. Вставьте в камеру фиктивную чашку с водой и дайте камере уравновеситься до 37 градусов по Цельсию, а затем поддерживайте стабильную температуру.
Чтобы настроить визуализацию, включите микроскоп, компьютер и все необходимые периферийные устройства. В зависимости от источника света подождите, пока он не понадобится. Когда револьверная головка объектива находится в низком положении, выберите объектив с числовой апертурой 20x 0,7.
Затем поместите образец над объективом, что облегчит поиск клеток, когда образец находится в камере. После переноса визуализируемых ячеек в климатическую камеру, согласно текстовому протоколу, запечатайте камеру для поддержания стабильной среды и включите атмосферный газ. Затем выберите условия изображения, которые предотвратят фототоксичность за счет ограничения времени экспозиции и использования света более низкой интенсивности.
Найти плоскости X, Y и Z и требуемые длины волн для каждой позиции, которую необходимо изобразить. Для долгосрочного промежутка времени большинства клеточных процессов получайте одно изображение каждые десять-двадцать минут. Более высокое временное разрешение обеспечивает большее количество точек данных и более надежное отслеживание клеток, но приводит к более интегрированному воздействию света и большим наборам данных.
Поскольку HT1080 FuGENE имеет динамические зеленые и красные флороресцентные белки, используйте следующее время воздействия и используйте контейнер два на два. В разделе «Расширенные настройки» включите программно-управляемую автофокусировку с использованием настроек по умолчанию. Определите диапазон автофокусировки 10 микрометров с рекомендуемым размером шага.
В экспериментальной чашке для уменьшения теплового дрейфа замените половину среды на среду, содержащую нужный препарат, которая была нагрета до 37 градусов Цельсия. Наконец, запустите таймлапс и получите изображения в соответствии с текстовым протоколом. В этих фильмах показаны примеры пары совместимых клеточных линий MCF7, полученных из рака молочной железы, которые отличаются только своим статусом p53, которые были обработаны противораковым препаратом, ингибирующим кинезин-5, что приводит к остановке митоза.
Как видно на этом рисунке, когда р53 удаляется путем стабильного нокдауна р53, вместо того, чтобы останавливаться после того, как они покидают митоз, клетки проходят через повторяющиеся циклы, в которых они вступают во второй раунд митоза, а не останавливаются, и покидают митоз без деления. Здесь показаны клетки Hela, полученные из карциномы шейки матки, стабильно экспрессирующие маркер хроматина Histone 2b, слитый с mCherry, и бета-тубулин, слитый с EGFP. При лечении препаратом, стабилизирующим микротрубочки, паклитаксолом, выравнивание хромосом и сегрегация нарушаются во время митоза, что приводит к образованию ядерных выпуклостей и микроядер, склонных к повреждению ДНК.
Эта клеточная линия стабильно коэкспрессирует два индикатора флороресцентного убиквитина клеточного цикла для CDT1, оранжевого цвета и геминина зеленого цвета, и нормально прогрессирует по клеточному циклу. Когда те же клетки обрабатываются ингибитором CDK46, клетки проходят через фазу G2 и делятся нормально, а затем сильно останавливаются в фазе G1, что указывает на потенциал аффективных цитостатических эффектов при растущих опухолях. Основное преимущество этого метода заключается в том, что вы можете отслеживать реакцию одной клетки непосредственно в режиме реального времени в течение многих дней, а не делать выводы об этих реакциях.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье описывается метод длительной таймлапс-микроскопии для отслеживания реакций отдельных клеток на противоопухолевые препараты. Этот метод позволяет исследователям в режиме реального времени наблюдать за гетерогенным терапевтическим ответом и судьбой клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Исследования рака
Теоретические основы
- Понимание клеточных ответов на противоопухолевые препараты имеет решающее значение для лечения рака.
- Анализ единичных клеток позволяет получить представление о клеточной гетерогенности.
- Таймлапс-микроскопия позволяет наблюдать за динамическими клеточными процессами.
- Линии клеток HT1080 и HeLa широко используются в исследованиях рака.
Цель исследования
- Для наблюдения за воздействием противоопухолевых препаратов на отдельные клетки.
- Для изучения механизмов, лежащих в основе различных терапевтических ответов.
- Для обеспечения метода долгосрочной визуализации поведения клеток.
Используемые методы
- Подготовка клеток HT1080 в культуральных чашках.
- Настройка климатической камеры для обеспечения стабильных условий визуализации.
- Использование таймлапс-микроскопии для регистрации клеточных ответов в динамике.
- Применение флуоресцентных маркеров для визуализации клеточных процессов.
Основные результаты
- Клетки с нокдауном p53 демонстрировали аномальное поведение при митозе.
- Обработка паклитакселом нарушала выравнивание хромосом в клетках HeLa.
- Обработка ингибитором CDK46 показала потенциальный цитостатический эффект.
- Отслеживание в режиме реального времени позволило изучить ответы на уровне отдельных клеток.
Выводы
- Данный метод позволяет детально наблюдать за реакциями отдельных клеток на воздействие препаратов.
- Визуализация в режиме реального времени может дать важные сведения о поведении раковых клеток.
- Этот подход расширяет понимание терапевтической эффективности и механизмов резистентности.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Продольное отслеживание отдельных клеток восполняет критический пробел в разработке онкологических препаратов, выявляя гетерогенные терапевтические ответы, которые маскируются при использовании популяционных анализов. Эта возможность повышает прогностическую достоверность при валидации мишеней и идентификации ведущих соединений, позволяя напрямую наблюдать за принятием клетками решений о своей судьбе, динамикой сигнальных путей и механизмами резистентности в течение длительных периодов времени. Данный метод способствует механистическому снижению рисков и обеспечению трансляционной непрерывности от этапа поиска до доклинических стадий, что позволяет оптимизировать распределение ресурсов в портфеле препаратов и принимать обоснованные решения о продвижении кандидатов с учетом рисков.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы путем прямого наблюдения гетерогенных ответов на противоопухолевые соединения в изогенных клеточных моделях.
- Практическая ценность: позволяет выявить специфические эффекты сигнальных путей, такие как остановка митоза, остановка в фазе G1 или индукция повреждения ДНК, с помощью показаний биосенсоров в режиме реального времени.
- Трансляционная ценность: способствует подбору биомаркеров путем установления связи между динамикой флуоресцентных репортеров (например, клеточного цикла, апоптоза) и функциональными результатами.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: обеспечивает получение стандартизированных количественных данных временных рядов о пролиферации, прохождении клеточного цикла и субклеточной локализации для скрининга соединений.
- Воспроизводимость: стабилизация в климатической камере минимизирует дрейф и появление артефактов, что позволяет проводить согласованные лонгитюдные измерения в разных повторностях.
- Масштабируемость: совместимость с многолуночными форматами и автоматизированным контролем фокуса обеспечивает поддержку кампаний по фенотипическому скринингу со средней пропускной способностью.
Трансляционные и доклинические исследования
- Значимость для изучения заболеваний: Моделирование контекста рака человека с использованием линий HT1080 (фибросаркома) и HeLa (карцинома шейки матки) с определенными генетическими пертурбациями.
- Снижение механистических рисков: Разграничение цитостатических и цитотоксических эффектов, а также выявление аберрантного повторного вступления в клеточный цикл как механизма резистентности.
- Преклиническая преемственность: Обеспечение связи между фенотипами взаимодействия с мишенью и функциональными исходами судьбы клеток в физиологически значимых временных рамках.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум поиска лекарственных средств — от валидации мишени до оптимизации лида, при которой динамические фенотипические показатели позволяют определять зависимости «структура — активность» и профили селективности.
- Биология открытий: Проверка гипотез относительно мишеней путем установления связи между воздействием препарата и изменениями пролиферации, динамики хромосом и апоптотических сигналов в режиме реального времени.
- Скрининг: Получение высокосодержательных данных с временным разрешением, подходящих для оценки влияния соединений на гетерогенные популяции клеток.
- Аналитика: Возможность извлечения кинетических параметров (например, продолжительности ареста, частоты повторного входа в цикл), которые позволяют проводить сравнительный ранжинг соединений.
- Трансляционные исследования: Связывание фенотипов in vitro с клиническими биомаркерами ответа и резистентности с помощью специфических для конкретных путей репортеров.
- Корпоративное повторное использование: Создание многоразовой платформы визуализации, применимой для различных онкологических показаний и классов мишеней.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность за счет выявления транзиторных, редких или отсроченных ответов, которые невозможно обнаружить с помощью конечных методов анализа.
- Операционная ценность: Стандартизирует долгосрочную визуализацию живых клеток в контролируемых условиях, повышая согласованность данных между различными исследовательскими группами.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go), позволяя на ранних этапах выявить такие механизмы ответственности, как митотическая катастрофа (mitotic slippage) или адаптивная резистентность.
- Влияние на портфель: Обеспечивает приоритизацию соединений на основе оценки рисков, опираясь на профили ответа единичных клеток и устойчивость эффекта.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области визуализации живых клеток, контроля условий окружающей среды и валидации флуоресцентных биосенсоров.
- Зависимость от систем инкубации на предметном столике, оборудования для коррекции дрейфа и высокочувствительных камер.
- Необходимы стандартизированные операционные процедуры для уравновешивания камеры, замены среды и поддержания фокуса.
- При адаптации метода следует учитывать управление фототоксичностью, спектральное перекрытие биосенсоров и плотность посева конкретных клеточных линий.
- Практические ограничения включают требования к хранению данных и сложность анализа при долгосрочном многопараметрическом отслеживании.
