Кожный Хирургическая Денервация: Метод для тестирования Требование нервах у мышей моделях болезни кожи

Общая цель данной процедуры заключается в изучении влияния нервов на нормальную и патологически измененную кожу. Этот метод может быть использован для поиска ответов на ключевые вопросы биологии нормальной кожи, например, влияют ли кожные нервы на гомеостаз и развитие заболеваний. Основным преимуществом данной методики является возможность сравнения образцов интактной и денервированной кожи одного и того же животного.

Визуальная демонстрация данной методики имеет решающее значение, так как нервы может быть трудно распознать и удалить с минимальным повреждением окружающих тканей. Сначала анестезируйте мышь и убедитесь, что она достигла надлежащего уровня седации, используя тест с зажимом пальца ноги. Также подтвердите, что у мыши нормальное дыхание и сердцебиение.

Теперь поместите животное на грелку в асептической хирургической зоне. С помощью электрического триммера осторожно удалите шерсть с дорсальной стороны в месте проведения биопсии. Затем протрите выбритую область салфетками с Betadyne и спиртовыми салфетками.

Убедитесь, что с места проведения процедуры удалены все состриженные волоски. Теперь обведите область биопсии черным маркером. Чтобы получить продольные срезы волосяных фолликулов, длинная сторона области биопсии должна быть ориентирована в направлении от передней части к задней, параллельно срединной линии спины.

С помощью скальпеля выполните полнослойное иссечение, не повреждая подлежащую мышечную фасцию. Кровотечение обычно минимально. Образец биопсии должен включать эпидермис, дерму, подкожный жир и panniculus carnosus.

Разложите вырезанный образец кожи на сухом бумажном полотенце дермой вниз. Обрежьте лишнее бумажное полотенце и, если необходимо собрать другие образцы, храните пробу в холодном TBS не более одного часа. Вернувшись к мыши, зашейте место биопсии нейлоновыми нитями 60, располагая швы примерно через каждые три миллиметра.

Затем наблюдайте за мышью в клетке для восстановления до тех пор, пока она не придет в сознание. Используйте анальгетики в соответствии с установленными правилами содержания животных в учреждении и следуйте их рекомендациям, если мышь выглядит встревоженной. Через семь-десять дней после операции удалите швы.

Приступите к обработке биоптатов для гистологического анализа или окрашивания препаратов в целом объеме. Проведите анестезию животного, выбрейте всю кожу на спине и очистите данную область аналогично процедуре забора биопсии. Теперь сделайте разрез стерильным скальпелем вдоль срединной линии спины от основания шеи примерно до отметки в половине сантиметра выше хвоста.

С помощью стерильного тупого пинцета осторожно оттяните кожу на левой стороне в сторону от бока, чтобы визуализировать подлежащие ткани от лопаточных жировых подушек в области шеи до уровня чуть выше задней конечности. Затем под диссекционным световым микроскопом найдите дорсальный кожный нерв. Он выглядит как белые нити, которые проходят каудально через прозральную фасцию стенки туловища, после чего резко изгибаются и входят в рыхлую соединительную ткань под кожей.

Затем с помощью ультратонкого пинцета удалите нервы исключительно с левой стороны животного в анатомических точках от T3 до T12, вытягивая их от мест изгиба сегментов у стенки туловища до мест их вхождения в кожу. Расположите пинцет вертикально и захватите нервы примерно на полсантиметра ниже мест их изгиба. После захвата потяните вверх, чтобы нервы растянулись и отделились от окружающих тканей для их последующего удаления.

Избегайте повреждения прилегающих кровеносных сосудов. Обязательно поддерживайте ткани во влажном состоянии на протяжении всей процедуры, периодически добавляя капли 0,9% стерильного физиологического раствора. Продолжайте удалять все нервы, идущие от стенки туловища к коже, но не затрагивайте нервы, расположенные внутри плотной фасции стенки туловища.

Затем удалите все нервы из обнаженного кожного лоскута. Эти волокна представляют собой дистальные ветви дорзального кожного нерва и выглядят как белые разветвленные нити, спорадически расположенные в соединительной ткани на дермальной стороне кожного лоскута. Чтобы удалить эти тонкие ветви, расположите пинцет примерно параллельно поверхности дермы, захватите нерв и вытяните его вверх.

Таким же образом удалите все видимые нервы. Не повреждайте кровеносные сосуды и кожу. На этом этапе важно избегать разрыва соседних кровеносных сосудов.

Если вы обнаружите нерв с прилегающим кровеносным сосудом, проследите за ним до области, где сосуд отсутствует, и удалите его путем вытягивания. Затем ослабьте кожу с правой стороны от разреза по средней линии спины, не удаляя никакие нервы. Эта область будет служить контролем противоположной стороны для имитации операции.

В завершение зашейте рану животного и в послеоперационном периоде проводите мониторинг, как и прежде. Позже, чтобы подтвердить стабильную потерю нервных связей, через несколько недель после операции осторожно уколите денервированный участок стерильной гиподермической иглой. Отметьте, реагирует ли животное, что обычно проявляется в виде содрогания или поворота головы.

Если участок кожи был стабильно денервирован, животное будет проявлять минимальную реакцию или не будет реагировать вовсе. Соберите биоптаты кожи из области отсутствия реакции и с противоположной стороны (ложнооперированной стороны) для получения соответствующих экспериментальных и контрольных образцов. Из биоптатов важно взять несколько гистологических срезов, чтобы выявить возможные различия в количестве или морфологии тактильных куполов между ложнооперированными и денервированными образцами.

Линия мышей glebe one cree ERT2 позволяет осуществлять тамоксифен-индуцированную генетическую рекомбинацию в областях кожи с высокой активностью сигнального пути hedgehog, например, в эпителии тактильных куполов. Эти мыши были скрещены с репортерными мышами induce abolaxi для визуализации эпителия тактильных куполов. Данные узлы имеют решающее значение для поддержания как нормальных тактильных куполов, так и связанных с ними клеток Меркеля.

Это демонстрируется экспериментально постепенным нарушением нормальной морфологии сенсорного купола (touch dome), а также исчезновением клеток, в которых откладывается кератин 8, после денервации. Нервы также имеют решающее значение для стимуляции сигналинга hedgehog в сенсорном куполе, что контролировалось по экспрессии Glebe one cree ERE2 и окрашиванию на home-mount beta collective sided как в ложнооперированной, так и в денервированной коже. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как хирургически аблировать дорсальные кожные нервы, чтобы проверить, участвуют ли эти нервы в нормальном функционировании кожи или модулируют ли они течение заболевания.

После освоения эта методика может выполняться регулярно и надежно с минимальным стрессом для животного. После данной процедуры можно использовать такие методы, как аминофлуоресцентное окрашивание, чтобы подтвердить полную абляцию нервов кожи, а также определить, затронута ли экспрессия генов.