Измерение

Общая цель данной процедуры заключается в количественном определении АТФазной активности очищенных белков in vitro для их функциональной характеристики. Этот метод может быть использован для характеристики новых предполагаемых АТФаз, оценки эффективности потенциальных активаторов или ингибиторов, а также для определения вклада конкретных доменов или остатков в АТФазную активность. Основным преимуществом данной методики является то, что она представляет собой простой и чувствительный способ измерения АТФазной активности in vitro и может быть легко оптимизирована.

Подготовьте стоковые растворы всех необходимых реагентов для инкубации с очищенным белком в соответствии с текстовым протоколом. Непосредственно перед постановкой реакции гидролиза АТФ смешайте 100 мМ хлорида магния и 100 мМ АТФ в соотношении один к одному. Подготовьте и промаркируйте пробирки объемом 1,5 мл для сбора образцов через равные промежутки времени в ходе реакции.

Подготовьте пробирки для сбора образцов в момент времени ноль, а также через 15, 30, 45 и 60 минут. Добавьте в каждую пробирку 245 µL 1x буфера HNG, чтобы разбавить образцы, отобранные из реакций гидролиза ATP, в разведении 1:50. Затем подготовьте баню из сухого льда и этанола для быстрого замораживания образцов с целью остановки реакции.

В резиновый ведерный контейнер для льда или другую подходящую емкость поместите несколько кусочков сухого льда и осторожно налейте достаточное количество 70%–100% этанола, чтобы покрыть сухой лед. Разбавьте очищенный белок в 1X буфере HNG и храните его на льду. Подготовьте реакции гидролиза АТФ в подготовленных пробирках объемом 0,5 мл, добавив предварительно рассчитанный объем воды для достижения конечного объема реакции 30 µL.

Затем добавьте 6 µL 5X HNG или другого буфера, 3 µL смеси 100 мМ хлорида магния и ATP, а также от 0,25 до 5 µM белка. Проведите инкубацию отрицательного контроля, содержащего только буфер без добавления белка. Затем отберите 5 µL из реакционной смеси в момент времени ноль.

Затем разбавьте аликвот в 50 раз в подготовленной пробирке объемом 1,5 мл, содержащей 245 µL буфера HNG. Немедленно заморозьте образец в бане из сухого льда с этанолом. Инкубируйте реакции при 37 °C в течение одного часа для обеспечения гидролиза ATP.

Через каждый интервал отбирайте из реакционной смеси аликвоты объемом 5 µL и переносите их в маркированные пробирки с буфером HNG, как было указано ранее. По завершении реакции гидролиза ATP переместите разбавленные образцы в морозильную камеру при температуре 80 °C для хранения. Чтобы убедиться, что все образцы полностью заморожены, подождите не менее 10 минут перед переходом к следующему этапу.

Разморозьте при комнатной температуре разведенные образцы, содержащие аликвоты реакции гидролиза ATP для каждой временной точки. Затем подготовьте 96-луночный планшет с образцами и стандартами фосфата. В пробирке объемом 0,5 мл разведите стандарт фосфата с 800 micromolar до 40 micromolar, добавив 5,5 microliters стандарта к 104,5 microliters буфера HNG.

Тщательно перемешайте и добавьте 100 µL этого 40 µM стандарта фосфата в лунку A1 96-луночного планшета. Добавьте 50 µL буфера HNG в лунки с B1 по H1 для проведения серийных разведений стандарта фосфата в соотношении один к одному. Перенесите 50 µL 40 µM раствора фосфата из лунки A1 в 50 µL буфера для анализа в лунке B1 и перемешайте.

Затем перенесите 50 мкл из лунки B1 в лунку C1, продолжая разведения до лунки G1. После перемешивания удалите 50 мкл из лунки G1, чтобы объем во всех лунках был одинаковым. Лунка H1 должна содержать только буфер для создания стандартного ряда фосфатов от 40 до 0 мкМ. Далее внесите в планшет по 50 мкл каждого образца в двух повторностях.

Разместите образцы, взятые в один и тот же момент времени, в колонках вертикально, а образцы из разных моментов времени — горизонтально. Это позволяет разместить до восьми образцов и пять временных точек на одной планшете. С помощью стерильной пипетки отберите достаточное количество детектирующего реагента малахитового зеленого мелиптата фосфата, чтобы добавить по 100 µL в каждую лунку, содержащую образцы и стандарты.

Добавьте детектирующий реагент в кювету для удобного дозирования с помощью многоканального пипеточного дозатора. Не наливайте детектирующий реагент непосредственно в кювету, так как существует вероятность загрязнения фосфатами. Используя многоканальный пипеточный дозатор, внесите 100 microliters реагента для детектирования фосфатов в каждую лунку и осторожно перемешайте, выполнив однообразное количество циклов аспирации и диспенсирования, избегая образования пузырьков; выполняйте процедуру в порядке от последнего временного интервала к первому.

Оставьте планшет при комнатной температуре на 25 минут или в соответствии с инструкциями производителя. Для количественного анализа результатов измерьте оптическую плотность образцов при 650 нанометрах с помощью микропланшетного ридера. Представлены репрезентативные результаты кинетического и конечного методов определения АТФаз, при которых активность форм дикого типа и мутантных форм АТФазы системы секреции II типа/EPSE определялась в присутствии и отсутствии стимулятора кардиолипина.

Здесь представлены результаты кинетического анализа АТаЗа, стимулируемого кардиолипином, демонстрирующие линейное высвобождение фосфата с течением времени для EPSE дикого типа и двойного мутанта по лизину, при этом бычий сывороточный альбумин служит отрицательным контролем. Эти данные могут быть представлены как количество высвобожденного фосфата в минуту, деленное на концентрацию белка, для количественной оценки и сравнения АТаЗа-активности каждого белка. Данные указывают на то, что два остатка лизина, K417 и K419, вносят вклад в стимулируемую кардиолипином АТаЗа-активность EPSE.

Сравнение АТФазной активности тех же белков без стимуляции кардиолипином показывает, что эти два остатка лизина не влияют на низкую базальную активность EPSE, а определяют способность белка стимулироваться кардиолипином. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как быстро и точно определить количественно АТФазную активность очищенных белков. При выполнении данной процедуры важно учитывать чувствительность реагента для определения фосфата.

Чтобы избежать загрязнения фосфатами, мы рекомендуем использовать одноразовые пластиковые изделия и ультрачистую воду, а также проводить гель-фильтрацию или ионообменную хроматографию после очистки белка.