Быстрая и конкретная оценка галогенирующего пероксидазной активности в лейкоцитами обогащается проб крови
28 июля 2016 г.
Этот протокол описывает быстрое обогащение лейкоцитов из небольших образцов крови для последующего специфического определения активности галогенирующей пероксидазы в клетках. Метод может быть применен к человеческому и нечеловеческому материалу и может способствовать оценке новых маркеров воспаления.
Общая цель этого метода истощения эритроцитов заключается в том, чтобы добиться быстрого и простого обогащения лейкоцитами из небольшого образца крови. Многие преимущества этой техники заключаются в том, что она дешевая, надежная и быстрая. Более того, его можно применять к образцам крови человека и нечеловека.
Перед началом процедуры лизиса отрегулируйте пипетку для подачи воды на два миллилитра, а пипетку для PBS на пять миллилитров. Затем поместите открытые колбы с водой и PBS под ламинарный вытяжной шкаф комнатной температуры. Поскольку гипотонический лизис является процессом, критичным по времени, все должно быть подготовлено заранее.
Более того, процедура лизиса всегда должна проводиться одним и тем же способом, чтобы получить совместимые результаты. Далее перелейте по 100 микролитров из каждого образца крови в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. И добавляем в каждый образец по два миллилитра дистиллированной воды с вихревом на среднем режиме.
Дайте клеткам отдохнуть в течение 60 секунд, затем добавьте пять миллилитров PBS. И перемешиваем образцы путем вортексирования. Теперь соберите клетки центрифугированием и сцедите надосадочную жидкость.
Переверните трубки и постучите по отверстиям на бумажном полотенце, чтобы удалить как можно больше жидкости. Затем повторите процедуру гипотонического лизиса, как показано только что на рисунке. После получения сухой гранулы во второй раз повторно суспендируйте каждый образец в 500 микролитрах HBSS, до получения однородного раствора.
И переложите ячейки в 1,5 миллилитровые, микроцентрифужные пробирки на льду. Чтобы проверить пероксидазную специфичность образцов после окрашивания аминофенолфлуоресцеином или APF, сначала добавьте пять микролитров ингибитора гемпероксидазы, 4-ABAH, в соответствующие образцы для 15-минутной инкубации при 37 градусах Цельсия. Далее добавьте по пять микролитров рабочего раствора APF в каждую пробирку, и аккуратно переведите клетки на средний режим.
Инкубируйте все образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Затем добавьте в каждый образец по пять микролитров рабочего раствора перекиси водорода, и аккуратно закрутите пробирки. Через 60 минут при 37 градусах Цельсия центрифугируйте клетки, и осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив гранулы.
Наконец, повторно суспендируйте клетки в 250 микролитрах HBSS и храните образцы в темноте до их анализа, чтобы избежать фотообесцвечивания. Здесь показан репрезентативный пример популяций лейкоцитов после гипотонического лизиса и окрашивания APF, как показано выше. Путем построения графиков зависимости размера клеток от зернистости можно наблюдать устойчивое истощение эритроцитов, при этом на эритроциты и популяцию мусора приходится только 22% событий.
Кроме того, распределение интенсивности флуоресценции, полученной из APF, способствует четкому различению пероксидаз-отрицательных эритроцитов и лимфоцитов, при этом наблюдается умеренное окисление APF для пероксидазоположительных моноцитов и эозинофилов, а также сильное окисление пероксидазы, проявляемое нейтрофилами. После освоения этой техники ее можно применять к 50 образцам крови параллельно, если она выполнена правильно. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как окрашивание антителами, для идентификации подмножеств клеток, представляющих интерес.
После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области исследований мелких животных для изучения роли галогенирующей активности МПО и ЭПО в животных моделях хронических воспалительных заболеваний.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном протоколе описан быстрый и простой метод обогащения лейкоцитов из малых образцов крови, применимый как для человеческого, так и для животных материалов. Этот метод является экономически эффективным и надежным, что облегчает оценку новых маркеров воспаления.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Иммунология
- Клеточная биология
Введение
- Обогащение лейкоцитов имеет решающее значение для изучения иммунных ответов.
- Традиционные методы могут быть трудоемкими и сложными.
- Данный метод направлен на упрощение этого процесса.
- Он может быть использован как для образцов крови человека, так и для образцов крови животных.
Цель исследования
- Разработать протокол экспресс-обогащения лейкоцитами.
- Оценить активность галопероксидазы в лейкоцитах.
- Внести вклад в идентификацию маркеров воспаления.
Используемые методы
- Подготовка пипеток для введения воды и PBS.
- Использование ламинарного шкафа для обработки образцов.
- Гипотонический лизис для удаления эритроцитов.
- Соблюдение временных интервалов при проведении процедуры лизиса.
Основные результаты
- Успешное обогащение лейкоцитов из малых образцов крови.
- Надежная оценка пероксидазной активности.
- Применимость как для человеческих, так и для животных образцов.
- Возможность оценки новых маркеров воспаления.
Выводы
- Метод является эффективным и экономически выгодным.
- Он расширяет возможности изучения иммунных ответов.
- Данный протокол может быть использован в качестве основы для дальнейших исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Данный протокол позволяет осуществлять быстрый стандартизированный обогащение лейкоцитов из малых образцов крови, что способствует ранним этапам поиска мишеней в исследованиях воспалительных заболеваний. Путем количественного определения галогенизирующей пероксидазной активности MPO и EPO метод обеспечивает механистический анализ для валидации мишеней и снижения рисков при изучении сигнальных путей. Совместимость метода с проточной цитометрией и окрашиванием антителами облегчает его интеграцию в рабочие процессы скрининга и трансляционные исследования.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать специфическую пероксидазную активность лейкоцитов для подтверждения MPO и EPO в качестве терапевтических мишеней при хроническом воспалении.
- Практическая ценность: требует минимального объема образца (50–100 µL), что позволяет проводить повторный забор проб у моделей на мелких животных для лонгитюдных исследований взаимодействия с мишенью.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: сочетание окрашивания APF с проточной цитометрией позволяет получать количественные показатели продукции HOCl/HOBr на основе флуоресценции для стандартизации анализа.
- Практическая ценность: обеспечивает высокопроизводительную обработку до 50 образцов параллельно, что позволяет проводить масштабируемые кампании по скринингу.
Трансляционные и доклинические исследования
- Научная ценность: Устанавливает связь между активностью лейкоцитарной пероксидазы и патологически значимыми воспалительными процессами, что способствует согласованию биомаркеров в доклинических моделях.
- Практическая ценность: Подходит для работы с кровью как человека, так и грызунов, обеспечивая межвидовую трансляционную преемственность при валидации мишеней.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод вписывается в континуум исследований — от первоначальной проверки гипотез о мишенях до доклинической валидации, особенно в рамках программ по изучению иммунологии и воспалительных заболеваний.
- Открывающая биология: обеспечивает проверку гипотез путем количественного определения специфической пероксидазной активности ферментов в очищенных популяциях лейкоцитов.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные результаты с помощью флуоресценции APF и проточной цитометрии, что позволяет оценивать влияние соединений на активность пероксидазы.
- Аналитика: позволяет получать измеримые данные об интенсивности флуоресценции для сравнения подмножеств пероксидаза-положительных клеток (нейтрофилов, моноцитов, эозинофилов) в экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: связывают активность пероксидазы с механизмами воспалительных заболеваний, обеспечивая преемственность доклинических исследований при сочетании с окрашиванием на маркеры клеточной поверхности.
- Корпоративное повторное использование: стандартизированное обогащение лейкоцитов и детекция на основе APF формируют универсальную платформу для работы с множеством мишеней воспалительных процессов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: обеспечивает достоверность прогнозов при валидации мишени за счет изоляции пероксидазной активности в конкретных линиях лейкоцитов.
- Операционная ценность: предлагает недорогой и быстрый протокол, требующий минимального набора оборудования (центрифуги, вортекса, проточного цитометра).
- Стратегическая ценность: сокращает сроки биологической минимизации рисков, позволяя проводить быструю и итеративную оценку модуляции мишени в образцах лейкоцитов.
- Влияние на портфель: способствует приоритизации ингибиторов MPO/EPO с учетом рисков за счет получения ранних данных о функциональной активности в физиологически релевантных клетках.
Особенности реализации
- Требуется опыт работы с лейкоцитами, проведение проточной цитометрии и знание химии флуоресцентных зондов.
- Необходимо наличие центрифуг, вортексных смесителей, ламинарных шкафов и проточных цитометров с соответствующими каналами флуоресценции.
- Для получения воспроизводимых результатов требуется стандартизация рабочих растворов APF и перекиси водорода между лабораториями.
- Адаптация метода для видов животных требует подтверждения экспрессии пероксидазы и эффективности окрашивания APF в целевых подмножествах лейкоцитов.
- Метод ограничен определением активности галогенизирующей пероксидазы; другие функции лейкоцитов не измеряются, если метод не комбинируется с дополнительными анализами.
