Изучение белка качества системы управления D. discoideum Использование Терморегулируемая живых изображений сотовый
2 декабря 2016 г.
Социальная амеба Dictyostelium discoideum недавно была создана как система для изучения неправильного сворачивания белка и протеостаза. В этой статье мы описываем новую методологию, основанную на визуализации, для изучения температурно-индуцированной агрегации белков и реакции клеточного стресса у D. discoideum.
Общая цель этого метода визуализации заключается в наблюдении клеточных возмущений, вызванных тепловым стрессом, в клетках Dictyostelium discoideum. Этот метод может помочь понять механизмы реакции на тепловой стресс и контроля качества белка у амебы Dictyostelium discoideum. Основным преимуществом этой методики является жесткий и точный контроль температуры, подаваемой на визуализацию файла клетки.
Чтобы начать процедуру, подготовьте клетки Dictyostelium, как подробно описано в текстовом протоколе. За день до визуализации разделите клетки на среду с низкой флуоресценцией до 10 000 клеток на миллилитр. Перед визуализацией соберите клетки из тканевой пластины в LFM, а затем перенесите достаточное количество клеток в стеклянные донные чашки.
Дайте клеткам отстояться в течение 20 минут, затем осторожно замените использованную среду свежей средой, чтобы удалить неосевшие клетки. Изображение ячеек в ненапряженных условиях при температуре 23 градуса Цельсия приобретает минимум шесть полей зрения. Приобретайте Z-стеки размером не более семи микрометров с шагом от одного до 0,25 микрометра, чтобы захватить весь объем ячейки.
Затем получите эталонное изображение яркого поля, чтобы оценить общее количество ячеек. Далее отрегулируйте температуру охлаждающей камеры до 30 градусов по Цельсию. После того, как отображение температуры достигнет нужного значения, выполните ручную перефокусировку в канале светлого поля.
Проверьте все записанные поля зрения перед началом таймлапса, затем запустите таймлапс для четырех часов теплового стресса с интервалом от пяти до 10 минут между временными точками. Проверьте правильность фокусировки во время съемки первых двух временных точек. После того, как тепловой стресс будет завершен, уменьшите температуру до 23 градусов по Цельсию.
Подождите, пока отображение температуры отрегулируется, и выполните ручную фокусировку. Затем записывайте цейтраферные видеоролики в фазе восстановления в течение 8–10 часов с интервалами от 10 до 20 минут. Проверьте правильность фокусировки во время захвата первой временной точки.
Для начала откройте пакет обработки изображений, оснащенный плагином Cell Counter. Загрузите стек изображений яркого поля, нажав «Файл», затем «Открыть». Далее откройте плагин Cell Counter, загрузите стек изображений, нажав Initialize.
Выберите тип счетчиков, нажав на соответствующее поле. После этого посчитайте общее количество ячеек, сохраните маркеры, нажав Сохранить маркеры. После сохранения маркеров загрузите максимальную проекцию гиперстека флуоресцентного изображения.
Откройте плагин Cell Counter и загрузите маркеры, нажав Load Markers. Далее выберите тип маркера для цитозольных очагов и подсчитайте клетки. Существующие маркеры можно использовать в качестве ориентира для положения отдельных ячеек.
Чтобы получить количество подсчетов на срезе, нажмите «Результаты», затем сохраните подсчеты в другом месте для дальнейших расчетов. В этом исследовании в клетках Dictyostelium наблюдалось распределение GFP-меченого полиглутаминового белка Q103. При нормальных условиях роста Q103-GFP диффузно распределяется в цитоплазме.
Во время теплового напряжения маркер Q103-GFP сливается с точечными структурами. При снятии напряжения и росте при нормальных условиях роста эти структуры растворяются. Перераспределение Q103-GFP и образование цитозольных очагов, вызванных тепловым стрессом, количественно определено с помощью анализа изображений.
Репрезентативные результаты реакции на тепловой стресс можно увидеть здесь. Количество клеток с цитозольными очагами Q103-GFP увеличивается при продолжающемся тепловом стрессе. Во время теплового стресса система контроля качества белка перегружена, поэтому склонные к агрегации белки не могут поддерживаться в растворимом состоянии.
После теплового стресса количество клеток с цитозольными очагами уменьшается, что позволяет предположить, что агрегированные белки растворяются. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как отслеживать возмущения, вызванные тепловым стрессом, у амебы Dictyostelium discoideum. Во время съемки важно помнить о том, что фокус правильно отрегулирован, если ваш микроскоп не оснащен аппаратной автофокусировкой.
Контроль температуры, показанный в этом протоколе, может быть использован за пределами области реакции на тепловой стресс. Визуализация в нормальных условиях роста с использованием контроля температуры может значительно снизить фототоксические эффекты.
Обзор
В данном исследовании представлена новая методика визуализации для изучения индуцированной температурой агрегации белков и клеточных стрессовых ответов у социальной амебы Dictyostelium discoideum. Этот метод позволяет точно контролировать температуру, что дает исследователям возможность наблюдать за влиянием теплового стресса на контроль качества белков.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Клеточная биология
- Нейробиология
- Агрегация белков
Теоретические основы
- Dictyostelium discoideum служит модельным организмом для изучения клеточных ответов на стресс.
- Понимание механизмов неправильного сворачивания белков имеет решающее значение для изучения различных заболеваний.
- Тепловой стресс может привести к агрегации белков, что влияет на функции клеток.
- Методы визуализации необходимы для наблюдения за клеточными процессами в режиме реального времени.
Цель исследования
- Разработать метод наблюдения за клеточными нарушениями, вызванными тепловым стрессом.
- Выяснить механизмы ответа на тепловой стресс у D. discoideum.
- Оценить эффективность контроля качества белков в условиях стресса.
Используемые методы
- Подготовка клеток Dictyostelium в среде с низкой флуоресценцией.
- Визуализация при контролируемых температурах (23°C и 30°C).
- Таймлапс-визуализация для мониторинга клеточного ответа в течение нескольких часов.
- Анализ изображений для количественной оценки агрегации и восстановления белков.
Основные результаты
- Белок Q103-GFP демонстрировал диффузное распределение в нормальных условиях.
- При тепловом стрессе Q103-GFP образовывал точечные структуры, что указывало на агрегацию.
- После стресса количество клеток с агрегатами снизилось, что свидетельствует о восстановлении.
- Данный метод успешно продемонстрировал динамику агрегации и растворения белка.
Выводы
- Данный метод визуализации позволяет получить представление о клеточных стрессовых реакциях.
- Контроль температуры имеет решающее значение для точного наблюдения за динамикой белков.
- Данная методология может быть применена в других областях исследований клеточного стресса.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для индустрии
Визуализация живых клеток Dictyostelium discoideum с контролем температуры позволяет точно исследовать механизмы контроля качества белков в условиях стресса, что способствует валидации мишеней на ранних стадиях для путей агрегации белков. Этот подход повышает прогностическую достоверность механистических исследований, имеющих значение для нейродегенерации и протеостаза. Способность данного метода снижать фототоксичность и количественно оценивать динамику агрегации белков предоставляет ценные данные для сортировки портфеля проектов в области биологических исследований.
Стратегические применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет напрямую наблюдать за динамикой агрегации белков в живой модели, реагирующей на стресс.
- Обеспечивает механистическое снижение рисков путем количественной оценки клеточных ответов на протеотоксический стресс, вызванный нагреванием.
- Способствует функциональной валидации мишеней системы контроля качества белков, имеющих значение при заболеваниях, сопровождающихся агрегацией.
Скрининг и разработка методов анализа
- Предлагает валидированный протокол визуализации для количественного анализа процессов агрегации и растворения белков.
- Снижает фототоксичность, что позволяет использовать более высокую интенсивность освещения для белков с низким уровнем экспрессии.
- Обеспечивает воспроизводимые количественные результаты, подходящие для последующих этапов скрининговых исследований.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует механизмам неправильного сворачивания и агрегации белков, имеющим значение при заболеваниях.
- Обеспечивает преемственность между механистическими исследованиями на стадии открытия и разработкой доклинических моделей.
- Поддерживает принятие решений по продвижению терапевтических средств, нацеленных на агрегацию, с учетом рисков.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол визуализации интегрирован в цикл исследований: от ранних механизмов до доклинической валидации мишеней агрегации белков.
- Биология открытий: позволяет количественно оценить агрегацию белков, вызванную тепловым стрессом, уточняя пути протеостаза.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимые количественные показатели агрегации для разработки анализов.
- Аналитика: предоставляет данные о количестве событий агрегации и динамике восстановления на уровне отдельных клеток.
- Трансляционные исследования: моделирует релевантные для заболеваний стрессовые ответы для сопоставления с биомаркерами.
- Корпоративное использование: предлагает стандартизированный, адаптируемый протокол для различных исследований контроля качества белков.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность валидации мишеней для путей агрегации белков.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и масштабируемость за счет стандартизации визуализации и анализа.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки («go/no-go»), предоставляя количественные механистические данные о протеостазе.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритизацию программ, направленных на борьбу с агрегацией, с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области визуализации живых клеток и количественного анализа изображений.
- Необходима микроскопия с контролем температуры и совместимое аналитическое программное обеспечение.
- Требуется межкомандная стандартизация параметров визуализации и интерпретации данных.
- Метод может быть адаптирован для других моделей белков, склонных к агрегации, при оптимизации протокола.
- Высокая подвижность клеток и чувствительность к фототоксичности требуют тщательного планирования эксперимента.
