Наблюдение и Количественное брачного поведения в Pinewood нематоды, Bursaphelenchus xylophilus
25 декабря 2016 г.
Представлен протокол исследования брачного поведения сосновой нематоды, Bursaphelenchus xylophilus. Поведенческие особенности B. xylophilus описаны в процессе спаривания.
Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы наблюдать за брачным поведением сосновой нематоды Bursaphelenchus xylophilus. Этот метод может помочь продвинуться в психологических исследованиях нематоды. В частности, речь идет о наблюдении за брачным поведением сосновой нематоды.
Главное преимущество этой методики заключается в том, что можно получить девственных взрослых особей, что значительно облегчает наблюдение за брачным поведением взрослых особей. Последствия этого метода распространяются исключительно на более широкое изучение нематод, потому что они имеют схожее поведение в жизненных циклах. Для демонстрации этого метода крайне важно так как приобретение девственных взрослых нематод затруднено, так как ограничения развития нематод требуют практики, а точно отличить самцов от самок у молодых особей на ранних стадиях первой стадии непросто.
Для культивирования сосновых нематод сначала готовят картофельную декстрозу агаровыми пластинками. Чтобы сделать прививку пластине, пробейте кусок грибкового мата диаметром 10 миллиметров из мата betritus senaria и поместите его в середину новой пластины PDA. Культивируйте грибковый коврик в течение пяти дней при температуре 25 градусов Цельсия в темноте.
Через пять дней добавьте сосновых нематод в подготовленную чашку Петри и выращивайте их в течение трех дней при температуре 25 градусов Цельсия в темноте. Чтобы изолировать нематод от грибка, сначала приготовьте средство для сбора. Поместите зажатую резиновую трубку под воронку, а подготовленную воронку подержите в стойке для сборки аппарата воронки Бермана.
Затем поместите два слоя фильтровальной бумаги вместо марли в горлышко воронки. Теперь перенесите грибковые культуры в воронку и добавьте воду до тех пор, пока грибковый мат не будет погружен. Через два часа нематоды выйдут из грибковой культуры, пересекут фильтровальную бумагу и поселятся в самой нижней части воронки Бермана.
Соберите нематод, поместив 15-миллилитровую трубку ниже воронки, затем медленно отпустите зажим, чтобы собрать несколько капель воды, в которой будут содержаться нематоды. Центрифугируйте скопления нематод при 3000 G в течение двух минут при комнатной температуре. Затем обеспылите верхний уровень воды, и снова суспендируйте червей в одном миллилитре воды.
Переложите суспензию нематод в шестисантиметровую стеклянную посуду и добавьте три миллилитра воды, чтобы помочь нематодам свободно плавать. Теперь собираем яйца, чтобы сделать девственные бульоны. Переложите блюдо в темный инкубатор, и дайте беременным самкам отложить яйца в течение 10 минут.
Из-за их гликопротеиновой поверхности яйца будут прилипать к стеклу. Далее аккуратно удалите воду с червями, чтобы не потревожить прилипшие к посуде яйца. Затем быстро добавьте обратно 3 миллилитра воды в блюдо, чтобы яйца не высохли.
Повторите этот процесс очистки яиц не менее трех раз, чтобы удалить всех личинок и взрослых особей и получить чистые яйца. К промытому чистому яичному сбору добавьте пять миллилитров воды, и приступайте к выявлению яиц в темноте при температуре 25 градусов Цельсия. Через 24 часа после начала культивирования яиц соберите вылупившихся личинок J2.
Аккуратно переложите личинки J2 в 15 миллилитровую трубку. Затем центрифугируйте сбор при 3000 G в течение двух минут. Спарьте верхний слой воды, и добавьте обратно 200 микролитров воды.
Затем культивируйте личинки J2 на планшете PDA, приготовленном с помощью грибного мата. Через 52 часа большая часть личинок J2 разовьется в личинки J4 на ранней стадии. Соберите воронку Бермана и извлеките нематод из грибковых культур в течение двух часов, как описано ранее.
Пока ждете, приготовьте иголку для ковыряния червей. Нарисуйте наконечник из стеклянного капилляра, нагретого над спиртовой горелкой. Кончик должен быть около 50 микрон в диаметре, что примерно соответствует ширине тела взрослой нематоды.
Через два часа переложите личинки J4 в чистую чашку Петри, как описано ранее. Теперь займитесь сексом с нематодами под стереомикроскопом. Около двух третей личинок обычно составляют самки.
Анатомия женской вульвы, очевидно, отличается от анатомии самца, но поскольку черви очень активны, определение пола потребует практики. Наиболее важным шагом в этом протоколе является точное различение и отделение самцов от самок на ранней первой стадии. В противном случае, когда они станут взрослыми, будут смешанные и плохие.
И это затрудняет наблюдение за случкой. Постепенно подбирайте и перекладывайте червей в каплю воды на горку для самцов или самок. Чтобы обеспечить успех, два разных человека должны дважды проверить распределение полов.
Теперь переложите каплю воды, содержащую сексированных червей, на соответствующую грибковую культуральную пластину. Затем культивируйте девственниц в течение еще 24 часов, прежде чем изучать их брачное поведение. Чтобы понаблюдать за брачным поведением сосновых нематод, сначала подготовьте несколько вогнутых горок, добавив по 200 микролитров воды в каждую из их лунок.
Далее выберите одну подготовленную девственницу и перенесите ее на подготовленную горку. Подержите взрослых девственниц в колодце в течение часа, чтобы они могли адаптироваться к новой водной среде. Через час добавьте в лунку одну взрослую девственницу противоположного пола, используя пипетку.
Затем понаблюдайте за поведением при спаривании под стереомикроскопом и запишите поведение на видео для количественного анализа. Весь процесс спаривания обычно заканчивается за два часа. Каждые 30 минут добавляйте 50 микролитров воды, чтобы компенсировать испарение.
Чтобы исследовать брачный выбор и межполовую конкуренцию, сгруппируйте и наблюдайте за девственными нематодами двух различных комбинаций. Успешность спаривания взрослых девственниц составила около 87%, что намного выше, чем у случайно выбранных взрослых. Парам требовалось в среднем 83 минуты, чтобы завершить весь процесс спаривания, который состоит из четырех различных фаз.
Поиски, контакты, совокупления и промедления. В рамках этих фаз можно наблюдать множество специфических моделей поведения. Когда одна самка встречалась с несколькими самцами, возникал очевидный брачный выбор.
Самка обычно использует свою голову для контакта с одним самцом, обычно в области головы, тела, хвоста и гениталий. Затем самка совокуплялась с самцом или быстро покидала его и подплывала к другому самцу. Показатели успешности спаривания измерялись после первого контакта для различных комбинаций нематод.
Также имело место межсексуальное соперничество. Когда одна девственная самка смешивалась с тремя девственными самцами, самцы старались приблизиться и контактировать с самкой как можно больше, чтобы получить возможность спариваться с ней. Когда вульва была занята, другие самцы пытались нарушить процесс спаривания, используя сильные раскачивания тела или перетаскивание, чтобы разнять их.
Было замечено, что женская интерсексуальная конкуренция более или менее похожа на мужскую интерсексуальную конкуренцию. Из-за межполовой конкуренции частоты совокуплений с различными комбинациями значительно отличались. После своего развития этот метод проложил путь к исследованию поведенческой экологии у нематод.
После освоения эта процедура может быть завершена за 12 дней, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о точном отделении самцов от самок, то есть на ранних четырех стадиях, чтобы получить девственных взрослых
особей.Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол наблюдения за брачным поведением сосновой нематоды Bursaphelenchus xylophilus. Метод ориентирован на получение взрослых неспаривавшихся особей для облегчения изучения процессов спаривания.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейронаука
- Поведенческая биология
- Нематология
Теоретическая часть
- Bursaphelenchus xylophilus является значимым видом нематод.
- Изучение их брачного поведения может дать представление о жизненных циклах нематод.
- Получение девственных взрослых особей крайне важно для точности наблюдений.
- Различение самцов и самок нематод может быть затруднительным.
Цель исследования
- Для наблюдения за поведением при спаривании Bursaphelenchus xylophilus.
- Для продвижения психологических исследований, связанных с нематодами.
- Для разработки методов, облегчающих наблюдение за поведением при спаривании.
Используемые методы
- Протокол получения взрослых половозрелых нематод.
- Наблюдение за поведением при спаривании в контролируемых условиях.
- Идентификация самцов и самок нематод.
- Документирование поведенческих особенностей в процессе спаривания.
Основные результаты
- Успешный отбор взрослых неспаривавшихся особей для наблюдения.
- Подробные описания зарегистрированных форм брачного поведения.
- Анализ трудностей, связанных с определением пола нематод.
- Значение полученных данных для более широких исследований поведения нематод.
Выводы
- Данный протокол расширяет понимание поведения нематод при спаривании.
- Он закладывает основу для будущих исследований в области нематологии.
- В работе рассматриваются сложности, возникающие при получении и идентификации нематод.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Количественное наблюдение за брачным поведением Bursaphelenchus xylophilus позволяет проводить точное поведенческое фенотипирование, что крайне важно для раннего поиска и валидации мишеней в исследованиях нематод. Стандартизированный метод получения взрослых неполовозрелых особей и воспроизводимые поведенческие метрики способствуют снижению механистических рисков и проведению сравнительных исследований различных видов нематод. Данный протокол повышает прогностическую достоверность трансляционных исследований и сортировки портфеля в рамках паразитологических и этологических рабочих процессов.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишеней
- Обеспечивает строгую проверку поведенческих гипотез посредством контролируемого наблюдения за фазами спаривания и отдельными элементами поведения.
- Поддерживает функциональную валидацию мишеней за счет изоляции взрослых неспаривавшихся особей и количественной оценки показателей успешности спаривания.
- Способствует снижению механистических рисков путем разграничения динамики внутриполового и межполового соперничества.
- Предоставляет воспроизводимые поведенческие конечные точки для сравнительных исследований нематод.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет создать валидированные поведенческие тесты с использованием синхронизированных и разделенных по полу популяций нематод.
- Обеспечивает получение количественных данных, таких как продолжительность фаз и частота спаривания, для стандартизации анализа.
- Обеспечивает воспроизводимость и масштабируемость платформ поведенческого скрининга.
- Позволяет подготовить надежные системы для последующих исследований по воздействию соединений или генетических вмешательств.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет поведенческое фенотипирование с разработкой трансляционных биомаркеров на моделях нематод.
- Обеспечивает непрерывность процесса от этапа обнаружения до доклинической валидации, позволяя проводить сравнительный анализ поведения разных видов.
- Поддерживает принятие решений о дальнейшем продвижении проекта с учетом рисков на основе количественных поведенческих данных.
- Предоставляет сведения о механизмах, имеющих значение для систем нематод, релевантных конкретным заболеваниям.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный протокол количественного анализа поведения интегрируется в ранний континуум от этапа первичного поиска до доклинических исследований, обеспечивая поддержку при проверке гипотез, разработке методов анализа и трансляционных исследованиях в биологии нематод.
- Поисковая биология: Облегчает проверку нулевых гипотез и уточнение сигнальных путей посредством контролируемого наблюдения за поведением.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые поведенческие анализы с количественными результатами для проведения скрининга.
- Аналитика: Предоставляет измеримые конечные точки, такие как продолжительность фаз и показатели успеха спаривания, для статистического сравнения.
- Трансляционные исследования: Позволяет сопоставлять поведенческие фенотипы с доклиническими и релевантными моделями заболеваний.
- Применение в масштабе предприятия: Предлагает воспроизводимый протокол, адаптируемый к другим видам нематод и этологическим исследованиям.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозирования и снижает механистическую неоднозначность в поведенческих исследованиях.
- Операционная ценность: Стандартизирует поведенческие анализы для обеспечения воспроизводимости и масштабируемости между исследовательскими группами.
- Стратегическая ценность: Обосновывает решения о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет предоставления надежных поведенческих конечных точек.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию с учетом рисков и продвижение программ исследований нематод.
Рекомендации по реализации
- Требуется опыт в области культивирования нематод, определения пола и наблюдения за поведением с использованием стереомикроскопа.
- Необходим доступ к системам синхронного культивирования, средствам видеозаписи и инструментам количественного анализа.
- Требуется строгая стандартизация между исследовательскими группами при распределении по полу и оценке поведения.
- Методика может быть адаптирована для других видов нематод со схожими жизненными циклами и поведенческими характеристиками.
- Точность определения пола и обращения с образцами имеет решающее значение для предотвращения смешивания популяций и обеспечения достоверности результатов.
