Иммуногистохимии на парафиновых срезах Мыши Эпидермис Использование флуоресцентных антител

В эпидермисе. Иммуногистохимия является эффективным средством локализации специфических белков в компартментах их экспрессии. В данном видео мы демонстрируем надежный метод иммунолокализации белков в эпидермисе, который регулярно используется в нашей лаборатории.

Здравствуйте, я Тэмми из лаборатории доктора Турина, которая находится в малоэтажном корпусе научно-исследовательского института здравоохранения Оттавы в рамках программы по хроническим заболеваниям. Сегодня мы продемонстрируем процедуру иммуногистохимического анализа с использованием флуоресцентных антител на парафиновых срезах эпидермиса мыши. В нашей лаборатории мы оптимизировали протоколы иммунолокализации маркеров дифференцировки эпидермиса с использованием тканей, фиксированных в BO'S.

В рамках оптимизации мы поддерживаем кожу в расправленном состоянии, разложив ее на бумажном полотенце перед фиксацией. Данная процедура включает в себя препарирование эпидермиса, фиксацию, дегидратацию, заливку парафином, нарезку срезов, депарафинизацию, регидратацию, демаскировку антигенов, метку антителами и, наконец, монтирование и визуализацию с помощью эпифлуоресценции. Итак, приступим.

При использовании новорожденных мышей брить кожу спины не требуется. Однако, если используются более старые мыши с шерстью, необходимо выбрить шерсть на спине, чтобы она не мешала при вырезании фрагментов. Во время диссекции следует соблюдать осторожность, чтобы не касаться пинцетом тех участков кожи, которые будут использоваться в анализе.

Для этого мы просто обхватываем пинцетом край в месте предстоящего разреза, затем очень осторожно приподнимаем и разрезаем эпидермис, стараясь не затрагивать область, которую вы планируете использовать в эксперименте. При фиксации кожи важно следить за тем, чтобы она не сворачивалась внутри пробирки; она должна лежать ровно.

Чтобы предотвратить это, мы кладем кожу на бумажное полотенце, чтобы она оставалась плоской во время фиксации. Теперь, когда кожа ровно лежит на бумажном полотенце, мы обрезаем или подравниваем края, чтобы удалить участки, которые могли быть повреждены пинцетом. Затем разрежьте кожу на очень маленькие кусочки размером примерно 2 mm на 2 mm.

Теперь приступают к фиксации ткани. После разрезания кожи на удобные для работы фрагменты погрузите её в раствор буфера. Закройте пробирки крышками, оберните их парафильмом и поместите на шейкер-рокер.

При инкубации в течение ночи важно выдерживать образец в растворе Бойна строго от 16 до 18 часов. Более короткие или длительные периоды фиксации приведут к повреждению тканей. На этом инкубация завершена.

Промойте ткань в PBS, а затем проведите серию промывок этанолом, используя 30%, 50% и 70% спирт. Обратите внимание, что BO имеет желтый цвет и по мере проведения промывок, когда BO вымывается, цвет промывочного раствора становится все менее желтым. Промывку следует проводить дважды по 30 минут.

После последнего промывания в этаноле образцы помещают в свежий 70% этанол, где они могут храниться при температуре четыре градуса Цельсия до дальнейшей обработки. Заливка в парафин. При использовании замороженных тканей целостность структуры тканей выше, и образцы могут храниться в течение длительного времени. Как правило, специализированные центры обеспечивают получение более воспроизводимых результатов.

Однако, если в вашем распоряжении имеется соответствующее оборудование и квалифицированный оператор с необходимым опытом, срезы можно выполнять внутри лаборатории. Умение делать качественные срезы — это своего рода искусство. Поэтому мы пользуемся услугами специализированного центра.

После получения предметных стекол из центрального оборудования (Core facility) можно заметить наличие парафина на стеклах. Предметные стекла с тонкой пленкой парафина помещают на штатив, обернутый алюминиевой фольгой (по аналогии с запеканием картофеля), и инкубируют в течение пяти минут при 55 °C. По завершении инкубации быстро разверните фольгу и перенесите предметные стекла в толуол для трехкратной промывки по пять минут.

Очень важно помнить, что пятиминутные промывки должны быть строго регламентированы по времени; слишком длительная инкубация в толуоле может привести к повреждению ваших образцов. После трех промывок и обработки толуолом проведите быструю промывку в 100% этаноле. Поскольку этанол и толуол образуют осадок, который может помешать проведению эксперимента, этот шаг крайне важно не пропустить.

Затем образцы регидратируют путем инкубации предметных стекол в течение пяти минут в 95% этаноле, пяти минут в 70% этаноле, а затем дважды по пять минут в воде. На этом этапе ткани можно подготовить к окрашиванию гематоксилином и эозином. Для этой цели мы также пользуемся услугами центра коллективного пользования.

Для демаскировки антигенов налейте 500 мл однократного цитратного буфера в пластический стакан объемом один литр и погрузите в него предметные стекла. Не забудьте снять металлическую ручку и поместить стакан в микроволновую печь. Нагревайте в микроволновке на высокой мощности дважды по пять минут.

Не забудьте открыть дверцу, чтобы микроволновая печь остыла между двумя этапами инкубации. После завершения микроволновой обработки извлеките стекла из кипящего цитратного буфера и поместите их в лоток для окрашивания с теплой водой. Мы используем обычную теплую водопроводную воду; это необходимо для постепенного охлаждения стекол от температуры кипения до комнатной температуры.

Теперь можно промыть предметные стекла трижды по пять минут в PBS, после чего можно приступать к иммуногистохимическому анализу. Первым шагом при подготовке к иммуноокрашиванию необходимо просушить область вокруг образцов с помощью бумажной салфетки. Чтобы предотвратить перекрестное загрязнение антителами, мы разграничиваем область вокруг образцов с помощью жидкого блокиратора.

Подготовьте увлажненную камеру, поместив фильтровальную бумагу в чашку Петри. Смокчите ее водой, удалите излишки жидкости и поместите внутрь предметные стекла. Использование увлажненной камеры необходимо для того, чтобы предметные стекла не пересыхали в течение периодов инкубации.

Очень важно не допускать высыхания предметных стекол, так как это приведет к увеличению фонового сигнала. На этом этапе стекла блокируют в инкубационном буфере в течение 30 минут. После блокировки перенесите стекла обратно в штатив и инкубируйте в промывочном буфере.

Удалите излишки буфера точно так же, как вы делали это ранее. Поместите предметное стекло обратно во влажную камеру и инкубируйте с первичными антителами в течение одного часа при комнатной температуре.

По истечении одного часа инкубации поместите предметные стекла обратно в штатив и промойте промывочным буфером трижды по 10 минут. После промывки удалите излишки промывочного буфера вокруг образца с помощью бумажной салфетки. Поместите стекла обратно в увлажненную камеру и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре со вторичными антителами; после инкубации со вторичными антителами промойте образцы, трижды заменив промывочный буфер, по 15 минут за каждую смену.

Затем мы проводим промывку трижды по пять минут. В PBS удаляем излишки жидкости вокруг образца и протираем PBS с обратной стороны предметного стекла для последующего накрывания покровными стеклами. Мы используем мобильный раствор с 2,5% DAB co.

Чтобы уменьшить выцветание, по каплям добавьте на предметные стекла 80 µL раствора, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха. Затем очень медленно накройте покровным стеклом.

Следите за тем, чтобы не осталось пузырьков воздуха. Пузырьки нежелательны, так как они часто оказываются прямо на образце — именно там, где вам потребуется сделать снимки после высыхания мобильного препарата. Теперь всё готово. Осмотрите ваши предметные стекла.

На данном изображении представлен результат успешного окрашивания с использованием FITC-фильтра. При использовании объектива 20x мы видим Claudin 6, связанный со всеми супербазальными слоями эпидермиса. Наша лаборатория проявляет большой интерес к экспрессии и локализации клаудинов в эпидермисе.

Что касается плотных соединений и формирования эпидермального пермеабельного барьера, мы только что продемонстрировали вам метод проведения иммуногистохимического анализа кожи мыши. При выполнении этой процедуры важно помнить, что срезы ткани должны быть плоскими, а стекла не должны высыхать в промежутках между инкубациями. На этом все.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.