С открытым исходным кодом Анализ Одночастичного для супер-разрешение микроскопии с VirusMapper

Общая цель этой процедуры заключается в создании высокоточных молекулярных моделей вирусов или макромолекулярных комплексов путем применения анализа отдельных частиц к изображениям структур со сверхвысоким разрешением с флуоресцентно меченными компонентами. Этот метод может ответить на ключевые вопросы в области вирусологии, в том числе на белковую архитектуру сложных вирусов и на то, как она меняется в ходе инфекции. Основное преимущество данной методики заключается в том, что путем сбора нескольких изображений одной и той же структуры становится возможным создание высокоточной карты ее компонентов.

Хотя этот метод может дать представление о структуре вирусов, он также может быть применен к другим системам, таким как другие патогены и макромолекулярные комплексы в клетках млекопитающих. Во-первых, визуализируйте образец с помощью флуоресцентной микроскопии со сверхвысоким разрешением. Получение изображений нескольких полей зрения, содержащих от сотен до тысяч хорошо отделенных частиц без нежелательных флуоресцентных структур.

После того, как изображения будут получены и обработаны, импортируйте и объедините изображения в стек с интеркалированными каналами. При необходимости преобразуйте объединенное изображение из гиперстека в стек. Далее выберите «Extract Viral Structures» в подменю VirusMapper и укажите путь к файлу для извлеченных частиц.

Введите количество отображаемых флуоресцентных каналов. Установите в качестве опорного канала канал флуоресценции, в котором частицы имеют наиболее однородный вид. Если у этих частиц отсутствует центральный максимум, примените предварительное обнаружение гауссова размытия, чтобы вызвать появление одного из них.

Далее оценим диаметр самых крупных частиц в пикселях. Установите радиус ROI на чуть больше половины этого значения. Оцените количество необходимых ROI для каждого кадра.

Изначально используйте не более ста ROI. Установите максимальное перекрытие ROI на основе разделения частиц. Просмотрите ROI для этого кадра.

Отрегулируйте радиус, количество ROI и максимальное перекрытие, чтобы каждая частица в кадре была заключена в один ROI. Убедитесь, что ROI как минимум на несколько пикселей шире, чем у самых крупных частиц. Затем нажмите «ОК», чтобы запустить сегментацию.

Закройте образец изображения в менеджере ROI после извлечения. Не переименовывайте извлеченные наборы частиц. Выберите «Сгенерировать семена» и откройте папку, содержащую извлеченные данные о частицах.

Установите опорный канал и выберите все каналы, для которых должно быть сгенерировано начальное значение. Если нужно соответствовать предыдущим моделям, поверните семена на девяносто градусов. Для каналов, в которых частицам не хватает центрального максимума, увеличьте значение размытия по Гауссу перед выравниванием, как и раньше.

Если каналы не выровнены близко, включите коррекцию сдвига для неопорных каналов. Выполните поиск последовательно появляющейся структуры в последовательности частиц. Определите репрезентативную частицу и введите соответствующий номер кадра в поле «Используемые кадры».

Просмотрите полученные семена. Отбор семян является важнейшим этапом этой процедуры. Внимательно просматривайте исходные данные, чтобы определить одну или несколько структур для моделирования.

Качество модели в значительной степени зависит от выбора семян, которые точно отражают эти структуры. При необходимости отрегулируйте опорный канал, радиус размытия по Гауссу и коррекцию сдвига, чтобы оптимизировать идентификацию дополнительных кадров с похожими начальными значениями. Продолжайте добавлять кадры и настраивать параметры генерации до тех пор, пока средняя структура не будет наилучшим образом представлять наблюдаемую структуру в данных.

Введите имя папки и префикс файла для сидов. Нажмите OK", чтобы сохранить исходные изображения для последующего моделирования. Выберите «Создать модели на основе семян» и откройте папку с извлеченными частицами.

Загрузите средние значения начальных значений для каждого канала. При обнаружении структуры на основе ссылок выберите опорный канал для выравнивания. Известная структура частиц в одном канале может быть использована в качестве эталона для выравнивания второго неизвестного канала.

Это позволяет непредвзято отображать неизвестную структуру. Имейте в виду, что хроматический сдвиг между каналами должен быть предварительно скорректирован. Если при анализе выявляются небольшие различия или тонкие особенности модели, выберите Квадратная интенсивность изображения во время сопоставления шаблонов.

Установите минимальное сходство в диапазоне от шестидесяти до восьмидесяти процентов, а количество итераций — одно. Выберите модели и частицы, которые будут отображаться во время расчета, и создайте модели для предварительного просмотра. Проверьте модели предварительного просмотра.

Увеличьте минимальное сходство, чтобы включить в него только частицы с желаемой морфологией. При необходимости оптимизируйте другие параметры расчета модели и выберите дополнительные элементы в процессе создания модели, которые будут отображены при необходимости. Как только модели предварительного просмотра будут удовлетворительными, увеличьте количество итераций до десяти.

Задайте имя папки и префикс файла. Нажмите OK", чтобы сохранить стеки эволюции модели, содержащие все итерации окончательной модели. Рекомбинантный вирус коровьей оспы с двумя белками, помеченными зелеными и красными флуоресцентными белками, был визуализирован с помощью микроскопии структурированного освещения и смоделирован с помощью плагина VirusMapper.

Семена были сгенерированы отдельно для лобной и сагиттальной ориентации, каждая из которых была усреднена из пяти репрезентативных частиц. В зависимости от направленности вируса можно выделить одно или два боковых тела. Таким образом, для двух ориентаций могут быть созданы отдельные модели.

При выполнении этой процедуры важно помнить, что качество моделей во многом зависит от качества полученных исходных данных. В то время как анализ отдельных частиц может повысить точность, он не может компенсировать низкое качество изображений. После этой процедуры на этих моделях может быть выполнена дальнейшая количественная оценка или подгонка модели.

Это может помочь ответить на дополнительные вопросы, например, о наноразмерных изменениях вирусной архитектуры во время инфекции. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать программное обеспечение для анализа отдельных частиц VirusMapper для создания моделей молекулярной архитектуры из изображений со сверхвысоким разрешением.